一种C反应蛋白唾液检测试纸条及其制备方法与流程

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种C反应蛋白唾液检测试纸条及其制备方法。

背景技术：

C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白，半衰期19小时；血清CRP由肝脏合成，白细胞介素1b、6以及肿瘤坏死因子是其合成的最重要的调节因子；CRP的分子量为105500，由含有五个相同的未糖基化的多肽亚单位组成，每个亚单位含有187个氨基酸，这些亚单位间通过非共价键连结成环状的五聚体，并有一个链间二硫键。CRP能引发对侵入细胞的免疫调理作用和吞噬作用，而表现炎症反应。CRP作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病史，有助于随访病程。特别在炎症过程中，随访风湿病、系统性红斑狼疮、白血病等。

目前对C反应蛋白快速检测的方法和仪器较多，主要有胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法、免疫比浊法、化学发光法、酶联免疫法等检测方法，检测样本多为人血清、血浆或全血。但因为需要专业医护人员采集血样、结果判读依赖专业检测仪器等原因。患者无法完成家庭自测。

尽管以胶体金免疫层析技术为原理生产的的C反应蛋白检测试纸条已经得到了较为广泛的临床应用，但其检测样本为血液，目前国内外尚未有研制和生产以人体唾液作为检测样本的C反应蛋白唾液检测试纸条。现有的血液试纸条在其使用过程中存在如下不足之处：1、样本采集会带来一定的疼痛，为很多样本采集者难以接受；2、而采集血样时需要专业的医护人员，而且采集血样时会造成伤口，产生潜在危险，很不方便，不适用于患者家庭自测。

发明申请公布号CN 103217532A公开了一种C-反应蛋白检测试纸条。该试纸条的硝酸纤维素膜上设有在液体流动方向上顺序排列的第一单克隆抗体线、第二单克隆抗体线、第三单克隆抗体线以及质控线；所述第一单克隆抗体线包含5μgCRP单克隆抗体II，所述第二单克隆抗体线包含15μg CRP单克隆抗体II，所述第三单克隆抗体线包含5μg CRP单克隆抗体II；所述CRP单克隆抗体I的抗原表位与所述CRP单克隆抗体II的抗原表位不同。本发明的C-反应蛋白检测试纸条在诊断迅速的同时能对人群中CRP的含量＜1mg/L，1-3mg/L或＞3mg/L做出区分，能够准确判断出高危人群。该发明的缺点是采集血样会造成伤口，不适用于患者自测，使用不方便。

技术实现要素：

针对现有技术不足，本发明提供一种C反应蛋白唾液检测试纸条，包括反应膜和金标垫，所述反应膜为硝酸纤维素膜，其具有分别包被C反应蛋白单克隆抗体的检测线和羊抗鼠IgG的质控线；所述金标垫是包被有胶体金标记的C反应蛋白单克隆抗体的聚酯膜。

进一步的，所述C反应蛋白单克隆抗体为鼠抗C反应蛋白单克隆抗体。

进一步的，所述金标垫中胶体金标记的C反应蛋白的单克隆抗体的pH值为8.0～8.5，胶体金和C反应蛋白单克隆抗体的配比为6～24μg/ml胶体金。

优选地，所述聚酯膜中胶体金标记的C反应蛋白的单克隆抗体的pH值为8.2，胶体金和C反应蛋白单克隆抗体的配比为12μg/ml胶体金。

进一步的，所述金标垫是将金标复合物喷涂到聚酯膜上制备的，制备金标复合物时，首先将C反应蛋白单克隆抗体用稀释液稀释后加入到胶体金溶液中，并添加溶剂使胶体金粒子和抗体能够结合到一起，将已标记的胶体金溶液离心后取沉淀物，沉淀物再用金标复溶液溶解混匀即得。

进一步的，所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/L Tris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖，1％～5％蔗糖，0.1％～2％曲拉通X-100，0.1％～0.5％土温-20，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0。

进一步的，所述C反应蛋白单克隆抗体的包被浓度为0.5～1.2mg/ml，所述羊抗鼠IgG的包被浓度为0.8～1.5mg/ml。

优选地，所述C反应蛋白单克隆抗体的包被浓度为0.9mg/ml，所述羊抗鼠IgG的包被浓度为1.2mg/ml。

进一步的，所述包被浓度是由抗体稀释液稀释抗体获得的，稀释液是终浓度为0.01～0.2mol/L Tris，1％～3％海藻糖，1％～3％蔗糖，0.05％～0.1％叠氮钠；HCl调节pH值为7.2～7.8。

进一步的，所述检测试纸条还包括PVC塑料底板、上样垫、吸水垫；所述PVC塑料底板上依次相互搭接粘贴的上样垫、金标垫、反应膜和吸水垫。所述上样垫为本发明试纸条的加样区，反应膜为反应区。

本领域技术人员能根据需要，将本发明提供的试纸条的加样区制作为实际检测中可接受的装置，以利于唾液的收集。

进一步的，所述上样垫含有上样垫处理液，处理液配方为：0.85％氯化钠，1％～2％尿素，0.1％～0.5％土温-20，0.1％～0.5％S9表面活性剂，所述浓度均为配置后的终浓度；HCl调节pH值为8.0～9.0。

本发明还提供一种制备所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：

步骤一，制备C反应蛋白的单克隆抗体；

步骤二，制备硝酸纤维素膜：用抗体稀释液将C反应蛋白单克隆抗体稀释为浓度为0.5～1.2mg/ml、将羊抗鼠IgG稀释为浓度为0.8～1.5mg/ml，喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，且于37℃中干燥8～24小时，备用；所述抗体稀释液由终浓度为0.01～0.2mol/l Tris，1％～3％海藻糖，1％～3％蔗糖，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.2～7.8；

步骤三，制备金标垫：C反应蛋白单克隆抗体标记胶体金的pH值为8.0～8.5，以6～24μg/ml胶体金加入C反应蛋白的单克隆抗体，摇匀后静置，按质量比0.5‰～1‰，加入1％的PEG20000，摇匀、再加入10％的BSA，摇匀静置，离心，取沉淀物，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的5％～30％复溶，将复溶后的胶体金标记物喷涂于聚酯膜上，37℃，烘干8～24小时，得到金标垫；所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/L Tris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖，1％～5％蔗糖，0.1％～2％曲拉通X-100，0.1％～0.5％土温-20，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0；

步骤四，在反应支持物上依次相互搭接粘贴上样垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

依次将上样垫、胶体金标记的C反应蛋白单克隆抗体聚酯膜、包被有C反应蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、吸水垫在PVC塑料底板上进行组装；PVC塑料底板长度为30cm，用切条机裁切组装好的大板，裁成宽度为4mm的试纸条。所述反应支持物优选PVC塑料底板；所述上样垫优选玻璃纤维；所述吸水垫优选吸水滤纸。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过优化金标抗体复溶液、划膜抗体稀释液配方，优化标记过程和包被过程的工艺参数，使唾液检测试纸条能够满足产品设计的性能指标要求；

2、本发明通过优化上样垫处理液配方，解决了唾液样本粘稠、含有多种干扰物质等阻碍因素。在本发明提供的复溶液配方中，与传统配方相比增加了海藻糖，在划膜抗体稀释液配方中增加了海藻糖成分；在标记过程中，使用了BSA和PEG20000作为稳定剂，能对C反应蛋白单克隆抗体与氯金酸溶液的结合过程起到更好的保护。

3、本发明提供的检测试纸条检测，以人体唾液为检测样本，有效监测唾液中C反应蛋白，特异性强，重复性好，灵敏度高，最低检出量达到10mg/L，该试纸条操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

附图说明

图1为本发明所述检测试纸条的结构示意图；

图2为本发明所述检测试纸条检测阳性结果示意图；

图3为本发明所述检测试纸条检测阴性结果示意图；

图4为本发明所述检测试纸条检测无效结果示意图。

图中所示：1-上样垫，2-金标垫，3-反应膜，4-吸水垫，5-PVC塑料底板，T-包被C反应蛋白单克隆抗体的检测条带，C-包被羊抗鼠IgG的质控条带。

具体实施方式

以下实施例用以进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别说明，实施例中所用的试剂为市售。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

本发明用到的试剂，其来源如下：

化学试剂：氯金酸、Tris、海藻糖、蔗糖、土温-20、S9表面活性剂、柠檬酸三钠、PEG20000、氯化钠、氢氧化钠、叠氮钠、HCl均外购于国药集团北京化学试剂公司，试剂级别为分析纯；

牛血清白蛋白(BSA)外购于Sigma公司；

C反应蛋白的单克隆抗体外购于Hytest公司；

羊抗鼠IgG购于杭州隆基公司

硝酸纤维素膜外购于汕头伊能膜业有限公司

实施例1

本发明所述检测试纸条的制备方法的步骤如下：

1、制备胶体金：

准确量取100mL的纯化水，放入圆底烧瓶中，加热、搅拌至沸腾。将2mL1％氯金酸溶液加入到沸水中，继续加热、搅拌。当溶液再次沸腾时，准确量取2mL1.0％柠檬酸三钠溶液快速加入到溶液中，继续煮沸。仔细观察溶液颜色，当溶液由黄色变成紫黑色，最后变成酒红色稳定后，开始计时，继续加热10min即可。待溶液温度恢复至室温后，停止搅拌，用纯化水恢复体积至100mL，放置在4℃条件下避光保存备用。

2、制备C反应蛋白单克隆抗体金标垫2：

2.1所需原料：

C反应蛋白单克隆抗体；上述步骤1制得的胶体金溶液；1％的PEG20000；10％的BSA；聚酯膜；金标复溶液。

制备金标垫2：C反应蛋白单克隆抗体标记胶体金的pH值为8.0～8.5，以6～24μg/ml胶体金加入C反应蛋白的单克隆抗体，摇匀后静置，按质量比0.5‰～1‰加入1％的PEG20000，摇匀、再加入10％的BSA，摇匀静置，离心，取沉淀物，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的5％～30％复溶，将复溶后的胶体金标记物喷涂于聚酯膜上，37℃，烘干8～24小时，得到金标垫2；所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/L Tris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖，1％～5％蔗糖，0.1％～2％曲拉通X-100，0.1％～0.5％土温-20，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0；

复溶液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.01mol/L Tris，2％BSA，2％海藻糖，3％蔗糖，2％曲拉通X-100，0.2％吐温-20，0.5％PEG20000，0.1％氯化钠，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4，具体配置方法为(以100ml为例)：取100ml纯化水，依次加入0.001mol的Tris、2gBSA、2g海藻糖、3g蔗糖、0.2ml吐温-20、0.5gPEG20000、0.1g氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100，均匀搅拌30min，后加入0.05g叠氮钠均匀搅拌10min，用HCl调节pH值为7.4，4℃条件下避光保存备用。

2.2胶体金-C反应蛋白抗体标记过程：

C反应蛋白抗体标记的过程(用10mL胶体金标记为例)：取10mL制备好的胶体金溶液，用1.0％K2CO3调pH值至8.2后，移液器准确吸取1mg/mL C反应蛋白单克隆抗体120μL，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。加入10μL 1％的PEG20000，摇匀、再加入10μL10％的BSA，摇匀静置，离心，取沉淀物，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的10％复溶。

2.3胶体金标记物固相化，把1ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0.6cm×30cm的聚酯膜上，37℃，烘干8～24小时，铝箔袋密封，室温保存备用，经实验确定，C反应蛋白单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.2，胶体金和抗体的配比为12μg/ml胶体金。标记胶体金经复溶液处理后，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于聚酯膜上。

3、使用包被硝酸纤维素膜制备反应膜3：

将C反应蛋白单克隆抗体，用于包被检测线T，用划膜抗体稀释液稀释至0.9mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体，用于包被质控线C，用划膜抗体稀释液稀释至1.2mg/mL，然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.0μL/cm，喷嘴1与2间隔4mm。调试完成后，划膜包被，形成检测线-T线和质控线-C线，37℃，烘干8～24小时；待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用；划膜抗体稀释液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.1mol/lTris，2％海藻糖、0.4％EDTA，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。

4、制作上样垫1：

上样垫处理液配制方法为按以下组分终浓度进行配制：0.85％氯化钠，1.5％尿素，0.25％土温-20，0.5％S9表面活性剂，所述浓度均为配置后的终浓度；HCl调节pH值为8.0；

具体配置方法为(以100ml为例)：取100ml纯化水，边加热边加入0.85g氯化钠搅拌溶解，溶解后依次加入1.5g尿素、0.25ml吐温-20、0.5g S9表面活性剂常温搅拌溶解后，再均匀搅拌30min，后加入0.05g叠氮钠均匀搅拌10min，用HCl调节pH值为8.0，2-8℃条件下避光保存备用；

取上述上样垫处理液45ml，喷涂于25×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干8～24小时，得到上样垫1。铝箔袋密封，室温保存备用。

5、C反应蛋白胶体金检测试纸条组成：

PVC塑料底板5为6.5cm×0.4cmPCV板；

上样垫1为2cm×0.4cm的玻璃纤维；

金标垫2为0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的C反应蛋白单抗的聚酯膜；

硝酸纤维素膜尺寸为1.8cm×0.4cm，依次包被C反应蛋白单克隆抗体，羊抗鼠IgG，二者间隔4mm；

吸水垫4为2.7cm×0.4cm的吸水滤纸；按照由1-4的顺序依次组织；

上样垫1为加样区，硝酸纤维素膜为反应区。即形成了C反应蛋白检测试纸条，胶体金免疫层析法。

实施例2

本发明所述检测试纸条的制备方法如下：

1、制备胶体金：

准确量取100mL的纯化水，放入圆底烧瓶中，加热、搅拌至沸腾；将2mL1％氯金酸溶液加入到沸水中，继续加热、搅拌；当溶液再次沸腾时，准确量取2mL1.0％柠檬酸三钠溶液快速加入到溶液中，继续煮沸；仔细观察溶液颜色，当溶液由黄色变成紫黑色，最后变成酒红色稳定后，开始计时，继续加热10min即可；待溶液温度恢复至室温后，停止搅拌，用纯化水恢复体积至100mL，放置在4℃条件下避光保存备用。

2、制备C反应蛋白单克隆抗体金标垫2：

2.1所需原料：

C反应蛋白单克隆抗体；

上述步骤1制得的胶体金溶液；1％的PEG20000；10％的BSA；金标复溶液；聚酯膜。

复溶液按照以下终浓度组分进行配制：0.01mol/LTris，2％BSA，2％海藻糖，3％蔗糖，2％曲拉通X-100，0.2％吐温-20，0.5％PEG20000，0.1％氯化钠，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。

2.2胶体金-C反应蛋白抗体标记过程：

C反应蛋白抗体标记的过程(用10mL胶体金标记为例)：取10mL制备好的胶体金溶液，用1.0％K2CO3调pH值至8.2后，移液器准确吸取1mg/mL C反应蛋白单克隆抗体120μL，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。加入10μL 1％的PEG20000，摇匀、再加入10μL10％的BSA，摇匀静置，离心，取沉淀物，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的10％复溶。

2.3胶体金标记物固相化：

把1.25ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0.6cm×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干8～24小时。铝箔袋密封，室温保存备用。

标记胶体金经复溶液处理后，按每平方厘米70μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上。

3、采用包被硝酸纤维素膜制备反应膜3：

将C反应蛋白单克隆抗体，用于包被检测线T，用划膜抗体稀释液稀释至0.9mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体，用于包被质控线C，用划膜抗体稀释液稀释至1.2mg/mL，然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.0μL/cm，喷嘴1与2间隔4mm。调试完成后，划膜包被，形成检测线-T线和质控线-C线，37℃，烘干8～24小时。待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用。

划膜抗体稀释液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.1mol/lTris，2％海藻糖、0.4％EDTA，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。

4、制作上样垫1：

上样垫处理液配制方法为按以下组分终浓度进行配制：0.85％氯化钠，1.5％尿素，0.25％土温-20，0.5％S9表面活性剂，所述浓度均为配置后的终浓度；HCl调节pH值为8.0。配置好后放置于4℃备用。

取上述上样垫处理液45ml，喷涂于25×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h，得到上样垫1。铝箔袋密封，室温保存备用。

5、C反应蛋白胶体金检测试纸条组成：

PVC塑料底板5为6.5cm×0.4cmPCV板；

上样垫1为2cm×0.4cm的玻璃纤维；

0.4cm×0.4cm的金标垫2含有胶体金标记的C反应蛋白单抗聚酯膜；

1.8cm×0.4cm的硝酸纤维素膜依次包被C反应蛋白，羊抗鼠IgG，二者间隔4mm；吸水垫4为2.7cm×0.4cm的吸水滤纸；按照由1-4的顺序依次组织。上样垫1为加样区，硝酸纤维素膜为反应区。即形成了C反应蛋白检测试纸条，胶体金法。

实施例3

本发明的检测方法如下：

本发明的原理是将C反应蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维薄膜上，在聚酯膜上包被胶体金标记的特异性极强的C反应蛋白单克隆抗体。在检测时，如样本中没有C反应蛋白存在，胶体金标记的特异性抗体与膜区抗原结合形成两条红线，一条检测线T，一条质控线C，表明检测结果为阴性；如样本中存在C反应蛋白且C反应蛋白的浓度达到10mg/L时，C反应蛋白分子就与胶体金标记的C反应蛋白抗体结合，样本向前涌动时，会被包被在硝酸纤维素膜上的C反应蛋白单克隆抗体捕获，形成肉眼可见的紫或红色检测线，质控线包被的羊抗鼠IgG也能捕获胶体金标记的C反应蛋白单克隆抗体，从而形成一条紫或红色质控线，表明检测结果为阳性。

如图2所示，如果样本中C反应蛋白的浓度达到参考值水平为10mg/L，则在质控线C处出现一条红色条带，反应线T处也出现一条红色条带。反应结果为阳性。

如图3所示，如果样本中没有含C反应蛋白或C反应蛋白的浓度低于参考值水平10mg/L，则在质控线C处出现一条红色条带，检测线T处没有明显的红色条带，反应结果为阴性

如图4所示，无论样本中是否含有C反应蛋白，检测结果在“C”处都形成一条条带。此线是质控线，如果检测过程中C线不出线，表示该试纸条已失效，本次检测结果无效。

实施例4

本发明所述检测试纸条的性能评估试验：

用于性能评估的C反应蛋白唾液检测试纸条的批号分别为Lot1、Lot2、Lot3，包装规格为：2人份/盒。C反应蛋白校准品(品牌RANDOX，货号CP2179)。

1、最低检出量评估

1.1实验材料和方法：

将RANDOX的C反应蛋白校准品用样本稀释液分别配制成如下浓度的样品：15、12.5、10、7.5、5mg/L。样本稀释液的配方为0.01M PBS、0.5％BSA和0.3％NaN3。选择三批本发明实施例1制得的C反应蛋白唾液检测试纸条各15人份。取出检测试剂卡，平放于桌面上，用吸管垂直滴加3滴上述检测样本约80μL，于加样孔内，5分钟内观察结果，并记录。为确保结果的准确性，5分钟后不再进行结果判读。每个浓度的检测样本重复检测3次。

1.2实验结果：

本发明的最低检出量评估资料的试验结果见表1。

表1最低检出量评估实验结果

结果显示，当样本中C反应蛋白标准品的含量为15mg/L、12.5mg/L、10mg/L时C反应蛋白检测试剂的检测结果为阳性，其中C反应蛋白含量为10mg/L时，检测结果为弱阳性(+)，正确率为100％；当样本中C反应蛋白含量为7.5mg/L以及5mg/L时C反应蛋白检测试剂的检测结果为阴性(-)，正确率为100％。以上结果表明本发明试纸条的检测最低检出量不低于10mg/L。

注：阳性结果(+)：目测反应线紫红色，检测线颜色浅粉色，显色清晰；阴性结果(-)：目测反应线紫红色，显色清晰，检测线不显色或是仅有一条暗影，不能形成肉眼清晰可见的红色线。

1.3结论：

经过三批产品的实验证明，本发明提供的C反应蛋白唾液检测试纸条(胶体金法)的检测最低检出量不高于10mg/L，符合产品设计要求，见下表1。

2、特异性评估

2.1阴性参考品符合率实验：

2.1.1实验材料和方法：

阴性参考品包括浓度为10ng/ml的降钙素原(PCT)、1000ng/ml的肌红蛋白(MB)、100mg/l的人白蛋白(HSA)、正常人群的CRP阴性唾液样本5份。取此阴性参考品系列各1mL，放入洁净器皿恢复至室温备用；选择三批(C反应蛋白检测试剂各40人份。取出检测试剂卡，将其平放在桌面上，用吸管分别垂直滴加3滴上述检测样本(约80μL)于加样区内，3-5分钟观察结果，并做记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复5次。

2.1.2实验结果：

实验结果见表2。结果显示，用浓度为10ng/ml的降钙素原(PCT)、1000ng/ml的肌红蛋白(MB)、100mg/l的人白蛋白(HSA)样品和阴性唾液样本检测本产品，产品质控线均显色清晰，紫红色，检测线不显色，检测结果全部为阴性，正确率为100％。

表2阴性参考品符合率试验结果

2.1.3结论：

经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条对阴性系列对照品样本的检测结果全部合格，符合产品设计要求。

2.2阳性参考品符合率实验

2.2.1实验材料和方法：

阳性参考品系列为不同浓度的C反应蛋白校准品。将C反应蛋白校准品用正常人群CRP阴性唾液配制成如下浓度的样品：20、15、10mg/L。选三批检测试剂各9人份，取出检测试剂卡，平放于桌面上，用吸管垂直滴加3滴上述检测样本(约80μL)于加样孔内，5分钟内观察结果，并记录。为确保结果的准确性，5分钟后不再进行结果判读。每个浓度的检测样本重复检测3次。

2.2.2实验结果：

试验结果见表3。结果显示，当样本中C反应蛋白标准品的含量为20mg/L、15mg/L、10mg/L时C反应蛋白检测试剂的检测结果均为阳性，其中C反应蛋白含量为10mg/L时，检测结果为弱阳性(+)，正确率为100％；

表3阳性参考品符合率试验结果

2.2.3结论：

经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条阳性样本检测结果全部合格，符合产品设计要求。

2.3小结：

通过三批产品的阴性参考品符合率和阳性参考品符合率试验，结果表明本发明研制的C反应蛋白唾液检测试纸条，胶体金法在特异性方面充分满足了产品质量要求。

3、HOOK效应试验

3.1实验材料和方法：

将购自于RANDOX的C反应蛋白校准品用样本稀释液配制成150mg/L的样本。选择三批的C反应蛋白检测试剂各3人份，批号分别为Lot1、Lot2、Lot3。取出检测试剂卡，平放在桌面上，用吸管垂直滴加3滴上述检测样本约80μL，于加样区内，3-5分钟观察结果，并记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。

3.2实验结果：

C反应蛋白唾液检测试纸条(胶体金法)的HOOK效应评估资料的试验结果见表4，结果显示：三批试剂盒检测150mg/L的CRP样本时，所有试纸的检测结果均为阳性(+)，正确率为100％；

表4HOOK效应试验结果

3.3实验结论：

经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条的HOOK效应检测均为阳性，表明本产品的检测范围能达到150mg/L，符合产品设计要求。

4、重复性试验

4.1批内不精密度

4.1.1实验材料和方法：

将购自于RANDOX的C反应蛋白校准品用样本稀释液分别配制成如下浓度的样品：100mg/L10mg/L、5mg/L。选择三批(批号分别为Lot1、Lot2、Lot3)的C反应蛋白检测试剂各60人份。取出检测试剂卡，将其平放在桌面上，分别用吸管垂直滴加3滴上述检测样本(约80μL)于加样区内，3-5分钟观察结果，并记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复20次。

4.1.2实验结果：

C反应蛋白唾液检测试纸条(胶体金法)的批内不精密度评估资料的试验结果见表5，结果显示：同一批次相同浓度的CRP样本检测结果均相同，显色深浅一致，显色度均一。

表5批内不精密度试验结果

4.1.3实验结论：

经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条的批内不精密度良好，符合产品设计要求。

4.2批间不精密度：

4.2.1实验材料和方法将购自于RANDOX的C反应蛋白校准品用样本稀释液分别配制成如下浓度的样品：100mg/L、10mg/L、5mg/L。选择三批(批号分别为Lot1、Lot2、Lot3)的C反应蛋白检测试剂各60人份。取出检测试剂卡，将其平放在桌面上，分别用吸管垂直滴加3滴上述检测样本，约80μL，于加样区内，3-5分钟观察结果，并记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复20次。

4.2.2实验结果：

C反应蛋白唾液检测试纸条(胶体金法)的批间不精密度评估资料的试验结果见表6，结果显示：结果显示：三个批次相同浓度的CRP样本检测结果均相同，显色深浅一致，显色度均一。

表6批间不精密度检测结果

4.2.3实验结论：

经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条的批间不精密度良好，符合产品设计要求。