人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC‑MS/MS检测方法与流程

本发明属于生物分析领域，尤其是涉及一种人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法。
背景技术：
：尿中马尿酸(HA)、甲基马尿酸(MHA)以及扁桃酸分别是接触甲苯、二甲苯在人体内的代谢产物，是接触甲苯、二甲苯的生物监测指标，在规定的采样时间内测定它们在尿液中含量的变化，可以反映工人的中毒程度。研究其分析方法，在临床和职业病防治方面都有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种操作简单、检测效率高、成本低的马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度检测方法，尤其适合对尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的检测。本发明的技术方案是：人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：1)样品的制备取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，涡旋混匀，加与水等量的浓盐酸和水3倍质量的的氯化钠，涡旋混匀后，加入样品量5倍的乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min，15000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进样分析。2)UPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析液相条件：流动相：A:0.1％甲酸水溶液B:甲醇流速：0.3ml/min进样量：5μL柱温：45℃检测波长：254nm色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1梯度洗脱程序Time/minA％B％095548020610906.19558955质谱条件：表2待测成分和内标的质谱检测参数其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的浓度。为了取得更好的技术效果，样品的处理方法为：取100μL尿液，加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。以上甲基马尿酸包括2-甲基马尿酸和3-甲基马尿酸。以上方法中的步骤(3)标准曲线的制作过程如下：a.标准品处理：取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行分析，记录色谱图；马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列浓度为：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.标准曲线的制备以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为定量标准曲线。为了取得更好的技术效果，人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法中还包括质控品的检测和基质效应的检测。质控样品的制备取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30μL氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。马尿酸的质控样品浓度为：5，50，800μg/ml，甲基马尿酸的质控样品浓度为：5，50，800ng/ml，扁桃酸的质控样品浓度为：50，500，8000ng/ml。马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的出峰时间及检测方式：具体见表3。表3待测化合物出峰时间及检测方式检测样品RT(min)检测方式扁桃酸2.60质谱MRM马尿酸2.92UV(254nm)2-甲基马尿酸3.86质谱MRM3-甲基马尿酸5.07质谱MRM在UPLC-MS分析时，按照常规方法绘制马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸，根据其标准曲线可以确定4种马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸线性方程、相关系数、检出限和定量限，具体见表4。表4UPLC-MS/MS测定马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的线性方程，相关系数，检出限LOD和定量限LOQ本发明具有的优点和积极效果是：UPLC-MS/MS检测方法检测人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合检测多种食物或意外甲苯、二甲苯中毒的情况。附图说明图1是本发明的四种对羟基苯甲酸酯类的标准曲线图(A:扁桃酸；B:马尿酸；C:2-甲基马尿酸；D:3-甲基马尿酸)。图2是标线中的混合标准品色谱图(A:扁桃酸；B:马尿酸；C:2-甲基马尿酸；D:3-甲基马尿酸)具体实施方式实施例1分别取3份100μL的尿液，命名为样品1、样品2、样品3。(1)a.标准品处理：取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行分析，记录色谱图；马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列浓度为：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.标准曲线的制备以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为定量标准曲线，见图1。图2是标线中的混合标准品的色谱图。(2)按以下相同的处理方法3份样品：加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。按照
发明内容中的条件对2中样品的马尿酸、2-甲基马尿酸、3-甲基马尿酸和扁桃酸的上样检测，根据图1的标准曲线和表4中的线性范围计算各成分的含量，结果见表5。表5尿液样品中各成分含量测定实施例22.1回收率检测取100μL空白尿液，加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加入适量工作溶液，配制成低、中、高三个浓度的100μL的溶液(即同上述质控样品中各化合物对应的浓度)，平行配置6份，取5μL进样分析。用水配制低、中、高三个浓度的工作溶液(即同
发明内容中质控样品中各化合物对应的浓度)，平行配置6份，取5μL进样分析。结果见表6。2.2基质效应检测取100μL空白尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。另外，用水配制低、中、高三个浓度的工作溶液(即同
发明内容中质控样品中各化合物对应的浓度)，取5μL进行样分析。基质效应样品的制备：取90μL水，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，取上清5μL进行样分析。马尿酸的基质效应浓度点为：5，50，800μg/ml，甲基马尿酸的基质效应浓度点为：5，50，800ng/ml，扁桃酸的基质效应浓度点为：50，500，8000ng/ml。结果见表7。表7液液萃取试验方法的基质效应以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。当前第1页1 2 3