一种模拟原位河岸带土壤的铁氨氧化过程的装置及使用方法和应用与流程

本发明属于生态工程技术领域，具体涉及一种模拟原位河岸带土壤的铁氨氧化过程的装置及使用方法和应用。

背景技术：

随着我国经济的快速发展，工业和农业生产以及生活污水的排放逐步增加，大量的氮和磷进入河流、湖泊、水库、海湾等，导致水体溶解氧下降，水质恶化，富营养化严重，造成严重的环境污染，破坏了生态平衡，铁氨氧化是最近发现的在厌氧环境中能进行氮素脱除的一种，其中，铁还原菌是铁氨氧化重要的脱氮微生物，存在于水稻田、滩涂湿地、河流及湖泊中，对铁氨氧化在河岸带的研究，有助于控制氮污染、保护生态环境，同时对河流生态修复具有重要的理论和现实意义。

无机氮素在自然界中主要有N₂、NH₃、NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-多种形态存在，其中NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-是无机氮素在水体环境中的重要形态，无机氮在生态系统中输入、迁移、转化、循环和输出的规律（例如：申请号CN201610018892.7 一种模拟原位河道生态系统氮归趋的装置和使用方法），无机氮主要通过反硝化和厌氧氨氧化两个微生物过程去除，以N₂、N₂O等气体形式离开湖泊系统（例如：申请号CN201410633441.5 一种模拟原位河道底泥厌氧氨氧化过程的装置和使用方法及应用）。

近年来，随着同位素示踪和分子微生物技术在厌氧氨氧化过程的应用，使得更好的理解其过程。Lijun Hou等（Scientific Reports, 2015, Anaerobic Ammonium Oxidation and its Contribution to Nitrogen Removal in China’s Coastal Wetlands）通过同位素示踪和分子微生物技术对中国沿海湿地厌氧氨氧化细菌的丰度、多样性以及脱氮进行了研究；Lidong Shen 等（Environmental Science and Pollution Research, 2016, Evidence for Anaerobic Ammonium Oxidation Process in Freshwater Sediments of Aquaculture Ponds）证明了水产池塘中的厌氧氨氧化过程，而有关厌氧氨氧化耦合铁还原（称为铁氨氧化）的研究较少，铁氨氧化是三价铁离子被还原而NH₄⁺被氧化为N₂、NO₃^-、NO₂^-的过程。

Wendy H.Yang等（Nature Geoscience, 2012, Nitrogen Loss from Soil through Anaerobic Ammonium Oxidation Coupled to Iron Reduction）通过同位素示踪技术研究了深林土壤中铁氨氧化产生氮气，表明铁氨氧化能够造成氮的损失，Xiaofei Li等（Environment Science and technology, 2015, Evidence of Nitrogen Loss from Anaerobic Ammonium Oxidation Coupled with Ferric Iron Reduction in an Intertidal Wetland）在滩涂湿地报道表明，大约11.5-18 t N km^-2 year^-1损失与铁氨氧化有关，大约占到外部无机氮进入长江流域的3.1-4.9%。Longjun Ding等(Environment Science and technology, 2014, Nitrogen Loss through Anaerobic Ammonium Oxidation Coupled to Iron Reduction from Paddy Soils in a Chronosequence)在水稻田研究表明大约7.8-61 kg N ha^-1 year^-1的损失与铁氨氧化相关，同时也表明在富含Fe³⁺的稻田中，铁氨氧化速率加快，以及铁氨氧化作为在水稻田中氮损失的一个重要的途径。但是，到目前为止，如何在室内通过模拟河岸带原位环境，探究河岸带中的铁氨氧化过程的模拟技术方法还未见报道。采用人工模拟河岸带生态修复过程，进行包括水温、光照强度、溶解氧及水质参数等综合调控及优化，来研究原位河岸带中铁氨氧化过程的装置还未有开发。因此，研究此类技术和装置对氮素的脱除及富营养化河道水体治理具有重要意义。

技术实现要素：

本发明需要解决的技术问题：一是确认河道中是否存在铁氨氧化；二是探索氮污染，水质恶化以及多因素变化对铁氨氧化的影响。本发明提供了一种模拟原位河岸带土壤的铁氨氧化过程的装置，方便对铁氨氧化速率，铁还原菌丰度及微生物群落结构的测定；使用该装置可以为河岸带中氮素去除提供理论基础和实际意义，对于原位河道水质的改善和河流生态修复具有重要意义。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是这样的，一种模拟原位河岸带土壤的铁氨氧化过程的装置，包括圆柱形的透明柱体、设置于透明柱体上部的卤素灯，蓄水箱和氦气钢瓶，所述的透明柱体为双层结构，内层通过进水管与蓄水箱相连，该进水管上设置有恒流泵和进水阀；外层通过进气管与氦气钢瓶相连，外层的上方设置有可密封外层的环形密封盖，外层底部填充有高度为30-40 cm的原位河岸带土壤，外层填装河岸带土壤的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，所述的内层的侧壁上设置有可以调节外层液面高度的内出水阀，外层的侧壁上设置有调节外层水利停留时间的外出水阀，该装置填装河岸带土壤位置以及上部设置有底泥取样口和水样取样口。

优选地，该装置还包括计算机主机和显示器，内层内设置有温度探头、溶解氧探头和pH探头，三者通过计算机主机与显示器相连，所述的温度探头、溶解氧探头和pH探头所检测数据实时显示在显示器上，以对内层水体内的温度、pH、溶解氧实时在线检测。

优选地，柱体高为80 cm，内层直径为20 cm，外层直径为30 cm。

其中，氦气钢瓶的作用为了在外层的底部填充河岸带的土壤后，向外层内充入氦气，以形成厌氧环境，便于培养，有利于对铁氨氧化的测定。

所述的蓄水箱内盛装原位河道采集的河水，由恒流泵，通过进水阀进入内层中，再由内层侧壁上的出水阀进入外层，保持了装置中的水体与原位河岸带的水体一样。

内出水阀的作用时为了调节外层水面高度，外出水阀的作用是调节外层水力停留时间，便于模拟河岸带水力停留周期，同时有利于保持内外层柱体的水质相同。

上述模拟原位河岸带土壤的铁氨氧化过程的装置的使用方法，包括如下步骤：

（1）外层河岸带土壤的添加：在2 h内将采泥器采集的河岸带的土壤运回实验室进行转移，装入上述装置的外层中，使外层底泥厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；

（2）内层水环境的构建：采集原位河道中的河水加入蓄水箱中，通过恒流泵将蓄水箱中的河水通过进水管引入到内层中；

（3）外层水环境的构建：打开内层上的内出水阀进行外层水体的填充，与此同时，打开密封盖，向外层内加入同位素¹⁵NH4⁺，待河水充满整个柱体外层，盖上密封盖；注水过程中，尽量采取无扰动的添加方式，使内层底泥不受到扰动；

（4）观察与分析： 模拟原位河岸带环境或调控环境因子的情况下，定期检测模拟装置水样中³⁰N₂，²⁸N₂的排放通量，以及水体中的总氮、Fe³⁺、Fe²⁺，从而分析确认铁氨氮氧化过程的存在以及环境因子与铁氨氧化之间的关系。

其中，调控的环境因子为营养盐浓度、光照强度、pH或温度。

内层营养盐浓度的改变：通过向蓄水箱中添加相应的盐实现。

光照强度的改变：采用卤素灯光源进行照射，通过光强计来进行测量。

本发明还提供了上述模拟原位河道底泥中铁氨氧化过程装置使用方法用于富营养化河岸带水体治理。

有益效果：

1、本装置设计合理，可模拟出原位河岸带的铁氨氧化过程，方便对铁氨氧化速率，铁还原菌丰度及微生物群落结构的测定。

2、本装置结构简单，成本低，易操作，制作方便，功能多样，可以方便地进行不同环境因子对铁氨氧化过程的影响的研究。

3、利用本装置确认了铁氨氧化过程的存在。

附图说明

图1.是本发明结构示意图;

1.氦气钢瓶 2.蓄水箱 3.恒流泵 4.进水阀 5.密封盖 6.内层柱体出水阀 7.温度探头 8.pH探头 9.溶解氧探头 10.卤素灯 11.底泥层 12.出水阀 13.计算机主机 14.显示器;

图2.实施例2小试实验中的水体中氨氮浓度随时间的变化；

图3.实施例2小试实验中的水体中硝酸盐氮浓度随时间的变化；

图4.实施例2小试实验中的水体中总氮浓度随时间的变化；

图5.实施例3小试实验中底泥的二价铁浓度随时间的变化；● 表示加¹⁵NH₄⁺的处理组■表示加去离子水的对照组；

图6.实施例3小试实验中底泥的三价铁浓度随时间的变化；● 表示加¹⁵NH₄⁺的处理组■表示加去离子水的对照组；

图7.实施例4小试实验中³⁰N₂随时间的变化；

图8.实施例4小试实验中²⁹N₂随时间的变化；

图9.实施例5河岸带不同样点土壤中三价铁还原速率比较；

图10.实施例5河岸带不同样点土壤中铁氨氧化速率比较；

图11.实施例6河岸带不同样点土壤中总氮去除速率比较；

图12.实施例7在河岸带不同样点土壤中铁还原菌的Geo的拷贝数；

图13.实施例7在河岸带不同样点土壤中铁还原菌的She的拷贝数；

图14.实施例8河岸带不同样点土壤中微生物群落结构。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实验所用的土壤和水样来自无锡贡湖亲水河。采集河岸带土壤及水样完成后，避光保存，在2 h内送回实验室，转移到本装置中，完成整个实验室室内模拟环境的构造。

实施例1

一种模拟原位河岸带土壤的铁氨氧化过程的装置，包括圆柱形的透明柱体、设置于透明柱体上部的卤素灯10，蓄水箱2和氦气钢瓶1，所述的透明柱体为双层结构，内层通过进水管与蓄水箱2相连，该进水管上设置有恒流泵3和进水阀4；外层通过进气管与氦气钢瓶1相连，外层的上方设置有可密封外层的环形密封盖5，外层底部填充有高度为30-40 cm的原位河岸带土壤11，外层填装河岸带土壤的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，所述的内层的侧壁上设置有可以调节外层液面高度的内出水阀6，外层的侧壁上设置有调节外层水利停留时间的外出水阀12，该装置填装河岸带土壤位置以及上部设置有底泥取样口和水样取样口。

该装置还包括计算机主机13和显示器14，内层内设置有温度探头7、溶解氧探头9和pH探头8，三者通过计算机主机13与显示器14相连，所述的温度探头7、溶解氧探头9和pH探头8所检测数据实时显示在显示器14上，以对内层水体内的温度、pH、溶解氧实时在线检测。

实施例2

室内模拟实验（考察模拟实验装置中水体中的氨氮，硝酸盐氮，总氮浓度随时间的变化）

实验方法步骤：

（1）在2 h内将采泥器采集的河岸带的土壤运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；

（2）采集原位河道中的河水加入蓄水箱中，通过恒流泵将蓄水箱中的河水通过进水管引入到内层中；

（3）打开内出水阀进行外层水体的填充，注水过程中，尽量采取无扰动的添加方式，使内层底泥不受到扰动；

（4）进行水质监测和分析，每隔24 h有水样取样口采集装置内的水样，分析氨氮、硝酸盐氮和总氮浓度随时间的变化，以确认无机氮去除过程是否的存在。

经测定，氨氮浓度、硝酸盐氮浓度和总氮浓度随时间逐渐下降，结果如图2，图3和图4所示，氨氮浓度最高为1.75 mg/L，最低为0.48 mg/L；硝酸盐氮浓度最高为0.61 mg/L，最低为0.29 mg/L；总氮浓度最高为2.73 mg/L，最低为1.08 mg/L。

实施例3

小试实验（考察模拟实验装置中，考察二价铁和三价铁随时间的变化）

实验组：

实验方法步骤：

（1）在2 h内将采泥器采集的河岸带的土壤运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；

（2）采集原位河道中的河水加入蓄水箱中，通过恒流泵将蓄水箱中的河水通过进水管引入到内层中；

（3）打开内出水阀进行外层水体的填充，与此同时，打开密封盖，加入同位素¹⁵NH₄⁺ Cl，使得柱体外层中¹⁵N的浓度为100 umol L^-1,待河水充满整个柱体外层，盖上密封盖；注水过程中，尽量采取无扰动的添加方式，使内层底泥不受到扰动；

（4）进行水质监测和分析，每隔24 h通过底泥取样口采集底泥，测定底泥中二价铁和三价铁随时间的变化。

对照组：

实验方法步骤与实验组相同，不同的是在步骤（3）中，用同体积的去离子水代替的¹⁵NH4Cl。

经测定，处理组（加¹⁵NH₄⁺）比对照组（加去离子水）的Fe²⁺浓度随时间逐渐上升，如图5所示，处理组（加¹⁵NH₄⁺）比对照组（加去离子水）的Fe³⁺浓度随时间逐渐下降，如图6所示，实验表明，处理组（加¹⁵NH₄⁺）比对照组（加去离子水）的Fe²⁺浓度增加的多，同时Fe³⁺浓度下降的也多。

实施例4

小试实验（考察³⁰N₂和²⁹N₂排放通量随时间的变化）

实验组：

实验方法步骤：

（1）在2 h内将采泥器采集的河岸带的土壤运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；

（2）采集原位河道中的河水加入蓄水箱中，通过恒流泵将蓄水箱中的河水通过进水管引入到内层中；

（3）打开内出水阀进行外层水体的填充，与此同时，打开密封盖，加入同位素¹⁵NH₄⁺ Cl，使得柱体外层中¹⁵N的浓度为100 umol L^-1，待河水充满整个柱体外层，盖上密封盖；注水过程中，尽量采取无扰动的添加方式，使内层底泥不受到扰动；

（4）进行水质监测和分析，每隔24 h通过水样取样口采集水样，用膜接口质谱仪分析²⁹N₂和³⁰N₂排放通量随时间的变化。

对照组：

实验方法步骤与实验组相同，不同的是在步骤（3）中，用同体积的去离子水代替的¹⁵NH₄Cl。

经测定，处理组（加¹⁵NH₄⁺）比对照组（加去离子水）的³⁰N₂的排放通量如图7所示，处理组（加¹⁵NH₄⁺）比对照组（加去离子水）²⁹N₂的排放通量如图8所示，从图中可以得知，对照组并没有检测到³⁰N₂和²⁹N₂的产生，处理组的³⁰N₂和²⁹N₂的浓度随时间逐渐增加。

实施例5

小试实验（考察不同样点中铁氨氧化速率）

实验组：

实验方法步骤：

（1）在2 h内将采泥器采集的河岸带的不同样点的土壤（命名为A、B、C、D 、E，分别取自无锡贡湖亲水河不同样点的土壤，具体为31°27'11 N, 120°19'27E、31°27'50 N, 120°20'07E、 31°27'54 N, 120°21'18E、31°27'59 N, 120°20'37E和31°28'01 N, 120°20'49E处表层10cm的土壤），运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；

（2）采集原位河道中的河水加入蓄水箱中，通过恒流泵将蓄水箱中的河水通过进水管引入到内层中；

（3）打开内出水阀进行外层水体的填充，与此同时，打开密封盖，加入同位素¹⁵NH₄⁺ Cl，使得柱体外层中¹⁵N的浓度为100 umol L^-1，待河水充满整个柱体外层，盖上密封盖；注水过程中，尽量采取无扰动的添加方式，使内层底泥不受到扰动；

（4）进行水质监测和分析，每隔24 h通过水样取样口采集水样，用膜接口质谱仪分析水样³⁰N₂的排放通量随时间的变化；同时通过底泥取样口采集底泥，测定底泥中三价铁随时间的变化。

对照组：

实验方法步骤与实验组相同，不同的是在步骤（3）中，用同体积的去离子水代替的¹⁵NH₄Cl。

经测定，处理组（加¹⁵NH₄⁺）比对照组（加去离子水）的河岸带不同样点土壤（A、B、C、D、E）中三价铁还原速率比较如图9所示；处理组（加¹⁵NH₄⁺）河岸带不同样点土壤（A、B、C、D、E）中铁氨氧化速率比较如图10所示；从图9得知，加¹⁵NH₄⁺的处理组中三价铁还原速率最高是C样点，为0.48 g Fe kg^-1 d^-1；从图10得知，铁氨氧化的速率（³⁰N₂的排放通量）最高也为C样点，为0.55 mg N kg^-1 d^-1，最低为D样点，为0.30 mg N kg^-1 d^-1。

实施例6

小试实验（考察不同样点中总氮去除速率）

实验方法步骤：

（1）在2 h内将采泥器采集的河岸带的不同样点的土壤（命名为A、B、C、D 、E，分别取自无锡贡湖亲水河不同样点的土壤，具体为31°27'11 N, 120°19'27E、31°27'50 N, 120°20'07E、 31°27'54 N, 120°21'18E、31°27'59 N, 120°20'37E和31°28'01 N, 120°20'49E处表层10cm的土壤），运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；

（2）采集原位河道中的河水加入蓄水箱中，通过恒流泵将蓄水箱中的河水通过进水管引入到内层中；

（3）打开内出水阀进行外层水体的填充，与此同时，打开密封盖，加入同位素¹⁵NH₄⁺ Cl，使得柱体外层中¹⁵N的浓度为100 umol L^-1，待河水充满整个柱体外层，盖上密封盖；注水过程中，尽量采取无扰动的添加方式，使内层底泥不受到扰动；

（4）进行水质监测和分析，每隔24 h通过水样取样口采集水样，分析总氮去除速率随时间的变化。

经测定，河岸带不同样点土壤（A、B、C、D、E）中总氮去除速率比较图11所示，土壤总氮的去除速率最高为C样点，为0.101 kg N m^-3 d^-1，而最低为D样点，为0.044 kg N m^-3 d^-1。

实施例7

小试实验（考察在河岸带不同样点，铁还原菌的丰度）

实验方法步骤：

在2 h内将采泥器采集的河岸带的不同样点的土壤（命名为A、B、C、D 、E，分别取自无锡贡湖亲水河不同样点的土壤，具体为31°27'11 N, 120°19'27E、31°27'50 N, 120°20'07E、31°27'54 N, 120°21'18E、31°27'59 N, 120°20'37E和31°28'01 N, 120°20'49E处表层10cm的土壤），运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；通过底泥取样口采集土样，分析河岸带不同样点土壤的铁还原菌She和铁还原菌Geo的拷贝数。

其中，铁还原菌Shewanellaspp. （She）和 Geobacteraceae spp.（Geo）的拷贝数采用Q-PCR方法测定：She 120F (5’-GCC TAG GGA TCT GCC CAG TCG-3’) 和 She 220R (5’-CTA GGT TCA TCC AAT CGC G -3’)作为Shewanella spp.的引物，Geo564F (5’-AAG CGT TGT TCG GAW TTA T-3’)和Geo840R (5’-GGC ACT GCA GG GGT CAA T A-3’)作为Geobacteraceae spp.的引物。

通过测定，河岸带不同样点土壤（A、B、C、D、E）中铁还原菌的Geo的拷贝数铁如图12所示，河岸带不同样点土壤（A、B、C、D、E）中铁还原菌Geo的的拷贝数铁如图13所示，从图12和 13中可以看出，在五个样点中，铁还原菌She和Geo的拷贝数最高值均为C样点，分别为0.99×10⁵ copies g^-1和1.48×10⁷ copies g^-1，铁还原菌She和Geo的拷贝数最低值均为D样点，分别为0.60×10⁵ copies g^-1和0.95×10⁷ copies g^-1。

实施例8

小试实验（考察河岸带不同样点土壤中微生物群落组成）

在2 h内将采泥器采集的河岸带的不同样点的土壤（命名为A、B、C、D 、E，分别取自无锡贡湖亲水河不同样点的土壤，具体为31°27'11 N, 120°19'27E、31°27'50 N, 120°20'07E、 31°27'54 N, 120°21'18E、31°27'59 N, 120°20'37E、31°28'01 N, 120°20'49E处表层10cm的土壤），运回实验室进行转移，分别装入实施例1所述的装置的外层中，使外层原位河岸带土壤厚度达到30-40 cm，充入氦气，盖上密封盖形成厌氧环境，外层土壤填充的位置外部包裹锡箔纸，保证河岸带土壤处于一个遮光的环境中，遮光处理两天；通过底泥取样口采集土样，分析河岸带不同样点土壤中微生物群落组成。

微生物群落组成采用Miseq方法测定：前引物采用515F (5’-GTG CCA GCM GCC GCG G-3’) ，后引物采用 907R (5’- CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3’) 。

经测定，河岸带不同样点土壤（A、B、C、D、E）中微生物群落组成如图14所示，从图中可以看出，变形菌门（Proteobacteria）是细菌中最大的一个门，而铁还原菌主要分布在变形菌门，这也可以间接反映铁还原菌的丰度，同时，还发现如绿弯菌门（Chloroflexi）酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门 (Actionobacteria)，这些都是自然底泥中非常重要的细菌。

由实施例5和7所测定的结果可看出，铁氨氧化速率高的样点，相应地铁还原菌She和Geo的拷贝数高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。