专利名称：噬氨副球菌hpd-2及其在土壤修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及噬氨副球菌，具体涉及一种噬氨副球菌HPD-2及其在多环芳烃污染土;裏 ^修复中的应用。
二背景技术：
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污 染物，由于其在环境中的半衰期较长和致癌、致畸、致突变的性质而受到人们的重视。美 国环保局在20世纪80年代初把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我 国也将其列入环境污染的黑名单中。苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene, B[a]P)是由五个苯环组 成的一种多环芳烃化合物，致癌性极强，是闺内外环境监测的重要指标之一。芘(Pyrene, PYR)和荧蒽(Fluoranthene， FA)都是四环的多环芳烃化合物，也具有一定的致癌作用。 三环以上的PAHs都属于高分子量PAHs。通常认为，PAHs的环数越高，越难被孩i生物降 解利用。
近年来，国内外对高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能够同时降解多种高分子 量PAHs (如四环和五环)的微生物资源还很少。目前有关副球菌属对PAHs的降解研究 较少，主要针对四环以下的PAHs，有学者发现能降解萘、蒽、菲、芴、荧蒽、屈、芘等 PAHs的副球菌属细菌。然而，至今还未报道能够同时降解B[a]P、芘和荧蒽的副球菌。事 实上，环境中PAHs通常以多种组分同时存在，呈现其复合污染现象。目前还没有发现能 够同时降解多种高分子量PAHs的微生物资源。
三
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供了一种能够 同时降解多种高分子量PAHs (如四环和五环)的微生物资源，该微生物为高分子量PAHs
降解菌嗟氨副球菌(户aracocow fl附/"ovorara) HPD-2 CGMCC No. 2568,该菌可以使溶 液中苯并[a]芘的含量降低89.7。/0,芘和荧蒽也有大幅降低，具有较广的降解谱；使污染土 壤中9种PAHs总去除率为22.9%，三环PAHs的降解率为36.1%,四环PAHs的降解率 为20.9%,五环PAHs的降解率为26.0%。该菌抹在PAHs污染土壤的生物修复中具有较 好的应用前景。
技术方案 一种喧氨副球菌(户flrflcocc船 fir附/wovonms) HPD-2， 该菌抹已在国家知 识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.2568。噬氨副球菌 (尸ar"coccw aw/"ovorara) HPD-2在降解高分子量多环芳烃污染土壤中的应用。噬氨副 球菌(P"racoccw awzwovorara) HPD-2在降解苯并[a]芘、芘或荧蒽污染土;裏中的应用。 噬氨副球菌(户amcoo^s am/wovora似)HPD-2的培养基，组成为K2HP04 6.0 g， KH2P04 5.5 g, Na2S04 2.0 g， KC12.0 g， NH4N03 2.0 g, MgS04.7H20 0.2 g，微量元素溶液1.0 mL， 高分子量多环芳烃3mg或50mg，该培养基pH 7.0-7.2。上迷高分子量多环芳烃为苯并[a] 芘、芘或荧蒽。
本发明提供一种高分子量多环芳烃的降解菌，其菌抹是一抹革兰氏阴性菌HPD-2 (2008年07月03日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏 号为CGMCCNo.2568),经鉴定为嗜氨副球菌(尸aracoccMScwi!'"ovoran5)。该菌林在平板 上生长48 h后呈乳白色凸起菌落，菌落直径约为l 4mm，表面光滑，边缘整齐。经染 色镜检，该菌为革兰氏阴性，球状，菌体直径为0.6~1.0nm (见图l、图2)。
该菌具有较高的降解高分子量多环芳烃的能力。将降解高分子量多环芳烃的 尸aracocctw fl附!7wvom附HPD-2 CGMCC No.2568菌^K接种于牛肉膏蛋白胨培养基摇瓶中， 振荡培养至对数期；将上述培养好的菌种按10。/o的接种量接种入500mL三角瓶，培养至 对数生长期。在B[a]P浓度为3.0 mg/L的培养液中生长5 d后，B[a]P的降解率为89.7%; 浓度为50 mg/L时，15 d后B[a]P的降解率为46.2% 。该菌抹对四环PAHs也有较好降解 能力，7 d后芘和荧蒽的降解率分别为47,2%和84.5% (见
图1 ~图6 )。
将尸aracoccm a附/"ovo/ww HPD-2 CGMCC No.2568菌液按20 %的接种量接入多环芳 烃污染土壤中，28 。C避光培养2周后结果发现，与对照相比，污染土壤中9种PAHs总 去除率为22.9%,三环PAHs的降解率为36.1%,四环PAHs的降解率为20.9%,五环PAHs 的降解率为26.0% (见图7 ~图8 )。该菌林在PAHs污染土壤的生物修复中具有较好的应 用前景。
本发明提供的CGMCCNo.2568菌能在苯并[a]芘、芘和荧蒽为唯一碳源和能源的无机 盐基础培养基中生长并降解利用高分子量PAHs，其培养基組成为K2HP04 6.0 g, KH2P04 5.5 g, Na2S04 2.0 g, KC12.0 g， NH4N03 2力g， MgS04-7H20 0.2 g，樣i:量元素溶液1.0 mL， pH为7.0-7.2。 12rC灭菌30min。
有益效果该降解菌具有较广的底物谱，对环境中的PAHs有很好的降解能力。
图1为菌株HPD-2在固体培养基上菌落形态(A)
图2为单菌林在透射电镜(15000倍)下的形态(B)
图3基于16S rRNA序列同源性的菌林HPD-2和相关细菌的系统发育树
图4为菌林HPD-2在B[a]P培养液中的生长曲线(A)
图5为培养液中B[a]P浓度随时间的变化(B )
图6培养7天后菌林HPD-2对PYR和FA的降解情况
图7土壤中各多环芳烃组分浓度随时间的变化
图8生物修复后土壤中三环、四环、五环PAHs及总PAHs的降解率(％)
五具体实施例方式
实施例1:虔氨副球菌(i arac< cci fl附/iKnwwis HPD-2 CGMCC No. 2568)的分离、
鉴定及其降解特性 1.1供试土壤
采自长江三角洲某地多环芳烃重度污染土:l裏。其基本理化性质为pH6.4,有冲几质 19.2g/kg，碱解氮1.0g/kg,全磷0.5g/kg,有效钾14.2 g/kg,阳离子交换量21.5cmol/kg。 16种EPA定为优先污染物的PAHs的总量达10.3 mg/kg。新鲜土i裏样品过2mm篩，于 暗处4'C保存。
1.2供试多环芳烃
B[a]P、 PYR和FA都购自Sigma公司(美国)，均为分析纯。 1.3培养类型
①牛肉膏蛋白胨培养基；②无机盐培养基(MS):每升含K2HPO4 6.0g， KH2P04 5.5 g, Na2S04 2.0 g， KC12.0 g, NH4NCb 2.0 g， MgS04'7H20 0.2 g,樣i量元素溶液1.0 mL (其
组成为1000 mL蒸馏水中溶解lg FeSO7H20， lg MnSO.H20, 0.25gNa2MoO4.2H2O， 0.1gH3BO4， 0.25gCuCl2.2H2O， 0.25gZnCl2， 0.1gNH4VO3， 0.25g Co(N03)2.6H20, O.lg NiS04.6H20)，蒸馏水1000 mL, pH7.0-7.2;③含PAHs的无机盐培养基以DMF配制 1000 mg/L的不同PAHs (B[a]P， PYR， FA)溶液，按B[a]P浓度(3.0 mg/L或5.0 mg/L) 及PYR， FA按(50.0mg/L)浓度加入灭菌的上述配方的无机盐培养基。 1.4 PAHs降解菌的分离与纯化
称取10 g上述新鲜供试土壤(即采自长江三角洲某地多环芳烃重度污染土壤)，加入 装有lOOmL无机盐液体培养基(B[a]P浓度为5.0 mg/L )的三角瓶中，28。C下200 r/min 振荡培养1周。按10%接种量转接到新鲜的B[a]P无机盐培养基中，继续培养1周，反 复5次。最后吸取O.l mL培养液稀释不同梯度涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，*沐 单菌落，将平板划线纯化后的单菌落再接种到B[a]P无机盐液体培养基中，选取生长速度 最快的菌林作为研究菌抹。
1.5菌种形态观察及鉴定
将已充分活化的菌抹接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28。C培养24h,革兰氏染色 后在光学显微镜下观察该菌抹在平板上生长48h后呈乳白色凸起菌落，菌落直径约为1 ~ 4mm,表面光滑，边缘整齐(见图l)。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性，球状，菌体直 径为0.6-1.0 jum。将活化菌种在牛肉膏蛋白胨平皿上划线接种，28。C培养箱中倒置培养 2d,观察菌落形态，并测量菌落大小。细菌样品经处理后用日立H-7650透射电子显微镜 (TEM)观察菌体结构。
1.6 16SrDNA的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建
利用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取细菌DNA。 用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物为BSF8/20: 5-AGAGT1TGATCCTGGCTCAG-3 ; 反向引物为 BSR1541 / 20 : 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。 PCR反应条件94。C 3 min; 94。C 1 min, 56°C 1 min， 72。C2min,循环29次；72。C10min。琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序由上海博 亚生物技术有P艮公司完成。降解菌16S rDNA序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据 进行比对分析。然后利用MEGA4.0软件构建系统发育树，采用Neighbor-Joining法进行 系统发育分析。
1.7菌悬液的制备
在无菌条件下将菌林接种于5.0 mg/L B[a]P无机盐液体培养基中，28。C下200 r/min
振荡培养l周，离心收集菌体，并用磷酸盐緩冲液反复洗涤3次，再用磷酸盐緩冲液将菌 悬液调至所需浓度备用。
1.8菌林对苯并[a]芘的降解
将该菌接种量为10%的菌悬液加入50 mL上述液体无机盐培养基中，以加灭活菌悬 液的处理作为对照(CK)，加入B[a]P,使B[a]P的最终浓度约为3.0mg/L,每个处理设3 个重复。28。C下200r/min避光振荡培养5天，在不同时段(O、 6、 12、 24、 48、 72、 96、 120h)取样，4。C冷冻保存。测定溶液中B[a]P的浓度和OD6oo的变化。
1.9菌抹对芘和荧蒽的降解
在50 mL液体无机盐培养基中加入该菌接种量为10%的菌悬液，以加灭活菌悬液的 处理作为对照，PYR和FA的最终浓度为50.0 mg/L,每个处理设3个重复。28°C下200 r/min 避光振荡培养7 d后取样，测定溶液中PYR和FA的浓度。
1.10溶液中多环芳烃的提取与分析
将三角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗，加入50 mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液 后用无水Na2S04去除水分。在水温为36。C的旋转蒸发器中旋转浓缩至干。加2.0 mL乙 腈溶解，用高效液相色谱(HPLC )测定培养液中多环芳烃含量。流动相为乙腈/水(60: 40), FA、 PYR和B[a]P的保留时间分别为32.5、 35.1和56.5 min。液相色谦为日本岛津 Class-vp高效液相色谱分析系统，配荧光检测器RF-10AXL,柱温箱OTO-10ASVP， 二元 梯度泵LC-10AT,色谙分离柱为美国Varian公司的ChrottiSpher 5 PAH。
2.1多环芳鋒降解菌林的菌落形态、细胞形态及生理生化特征及序列分析
该喧氨副球菌(尸aracocc附twH力ovorara) HPD-2 CGMCC No. 2568具有以下特征(1) 菌落形态特征在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h的菌落大小为直径1~4 mm,菌落呈圆 形，表面光滑，边缘整齐，凸起，乳白色(见图1)。 (2)菌体形态特征该菌为革兰氏 阴性，球状，不运动，菌体直径为0.6~1.0nm (见图2)。 (3)生理生化特征好氧生长， 氧化酶和接触酶均为阳性，不产色素，能利用曱胺、三曱胺及丙三醇，不能利用曱酸盐和 曱醇；能利用果糖和廿露醇，不能利用木糖和蔗糖；能利用硝酸铵和硫酸铵，不能利用尿 素。该菌的16S rDNA PCR产物约1.5 kb左右，16S rRNA序列同源性比对(图3 )表明， 该菌林16S rRNA序列与尸aracoca^a/m'"ovoram细菌的16S rRNA序列相似性高达99。/n 。 结合上述的形态鉴定与16SrDNA分析结果将此菌林鉴定为副球菌属，其编号为HPD-2。
2.2 HPD-2在苯并[a]芘培养基上的生长曲线
HPD-2在含有B[a]P的无机盐液体培养基中的生长曲线见图4。该菌林从接种到第6 h
生长緩慢，处于延滞期；从6h到12h，菌林开始加速生长，细胞数目开始有所增加；从 24h到48 h,细胞数目急剧增加，OZ)6w值从0.1快速增加到0.4,处于指数生长期；第 48h到96h, 0￡)600值变化不大，细胞处于稳定期；到120 h，细胞数目有所减少，进入 衰亡期。
2.3 HPD-2对苯并[a]芘的降解特性分析
无机盐液体培养基中B[a]P的浓度随时间的变化情况如图5所示。由图可知，B[a]P 的浓度从培养初期即开始下降，第24 h至48 h降低得最快，48h后下降的速度减緩，与 该菌的生长曲线呈现一定的对应关系。与培养初期相比，第120 h时加HPD-2的处理中 B[a]P的降解率达89.7。/0。
2.4 HPD-2对芘和荧蒽的降解特性
图6所示的是HPD-2培养7天后对PYR和FA的降解情况。从图中可以看出，PYR 和FA的浓度均明显低于对照，而且FA比PYR降j氐得更多。表明该菌对PYR和FA都有 一定的降解能力，且对FA的降解能力更强，它们降解率分别为47.2%和84.5%。本研究 中利用B[a]P生长的HPD-2仍然对PYR和FA表现出了较好的降解能力。
实施例2:谨氨副球菌(户amoicc附a附/"owra/is HPD-2 CGMCC No. 2568 )的土壤
修复效应
1.1供试土壤
采自长江三角洲某地多环芳烃污染土壤。土壤的基本理化性质为pH 6.4, 有机质 19.2g/kg,碱解氮1.0g/kg，全磷0.5g/kg，有效钾14.2g/kg，阳离子交换量21.5cmol/kg。 9种EPA定为优先污染物的PAHs的总量达10.78 mg/kg。其中，四环、五环PAHs的含 量分别占总量的71.8%和23.0%，说明该土壤中的PAHs主要由高分子量PAHs组成。新 鲜土壤样品过2mm筛后，于暗处4。C保存。
1.2培养类型
①牛肉膏蛋白胨培养基；②无机盐培养基(MS):每升含K2HPO4 6.0g， KH2P04 5.5 g， Na2SO42.0g， KC12.0g, NH4N03 2.0 g, MgS04.7H20 0.2 g,微量元素溶液1.0mL, pH7.0-7.2;③含PAHs的无机盐培养基以DMF配制1000 mg/L的不同PAHs (B[a]P, PYR, FA)溶液，按适当的浓度加入上述配方的灭菌无机盐培养基。
1.3供试菌抹
喧氨副3求菌尸aracocc^ flrm/"owrara HPD隱2 CGMCC No. 2568。
在无菌条件下将菌林HPD-2接种于含有50.0 mg/L苯并[a]芘的无机盐液体培养基中， 28。C下200r/min振荡培养至对数生长期，离心后收集菌体，并用磷酸盐緩冲液洗涤3次， 再用磷酸盐緩冲液将菌液调节吸光度(OD60())至适当浓度备用，含菌量为6.2x106 CFU/mL
1.5 PAHs污染土i裏的生物i多复试验
称取1000gPAHs污染土壤，加入200mLHPD-2菌液，混合均匀。以加入等量灭活 菌液的处理作为对照(CK),每个处理设3个重复。将土壤水分保持在田间持水量的60 %,于28。C下避光培养。在第O、 7、 14d取样，土壤样品4。C冷冻保存。1.6 土壤中PAHs的分析
称取2.0g风干土样于索氏管中，向茄形瓶中加入二氯曱烷70mL，索氏抽提24h。 取出后控制水温为36。C的旋转蒸发器中旋转浓缩至干，然后加入2.0 mL环已烷对茄形 瓶中物质进行溶解。另称1.0 g经400。C下处理4 h的干燥硅胶于小烧杯中，加10 mL 正已烷浸泡15min,然后装硅胶柱。吸取茄形瓶中环已烷溶解液0.5 mL过柱。用1:1正 已烷和二氯曱烷混合液进行洗脱，首次l.OmL洗脱液弃去，再接2mL洗脱液于刻度 试管中，用高纯氮气吹干。加2.0mL乙腈溶解，用Class-VP5XShimadzuHPLC测定 (钱薇等，2007 )。流动相为乙腈/水(60: 40 )。液相色谱为日本岛津Class-vp高效液 相色谱分析系统，配荧光检测器RF-10AXL，柱温箱OTO-10ASVP, 二元梯度泵LC-10AT， 色i普分离柱为美国Varian公司的ChromSpher 5 PAH。 2.1 土壤中PAHs的动态变化
微生物能够利用或P条解的污染物越多，在生物修复中的利用价值就越大，因此微生物 的降解底物谱是生物修复时选择微生物的重要因素。图7所示的是在生物修复过程中土壤 中各PAHs组分含量随时间的变化。从中可以看出，截至第14 d，所有加菌的处理中各 PAHs组分的浓度均明显低于对照土壤(PO.05 )，降解率均在19.5%~36.2%之间，其中最 高的是菲(36.2% )、蒽(35.4% )和苯并[a]芘(32.2% )。
从多环芳烃的环数看(图8),加菌处理中三环PAHs的降解率最高(36.1%),五环 次之(26.0% )，西环的最低(20,9% )， PAHs的总去除率为22.9%。
9
权利要求
1、一种噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.2568。
2、 根据权利要求1所述的噬氨副球菌(尸aracoccRsa附i"ovora"s) HPD-2,该菌 林在降解高分子量多环芳烃污染土壤中的应用。
3、 根据权利要求1所述的噬氨副球菌(户ar"cocci^a附z'"ovora朋)HPD-2,该菌 抹在降解苯并[a]芘、芘或荧蒽污染土壤中的应用。
4、 一种权利要求1所述的噬氨副球菌(户flracoccM )HPD-2的培养 基，其特征在于组成为K2HPO46.0g， KH2P045.5g， Na2SO42.0g， KC12.0 g, NH4NO32.0g, MgS04.7H20 0.2 g，微量元素溶液1.0mL,高分子量多环 芳烃3mg或50mg,该培养基pH 7.0-7.2。
5 、 根据权利要求4所述的噬氨副球菌(尸aracocciw "附/"ovorara) HPD-2的培养 基，其特征在于所述高分子量多环芳烃为苯并[a]芘、芘或荧蒽。
全文摘要
一种噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.2568。该降解菌具有较广的底物谱，对环境中的PAHs有很好的降解能力。
文档编号C12N1/20GK101348773SQ20081002233
公开日2009年1月21日 申请日期2008年7月18日 优先权日2008年7月18日
发明者李振高, 健 毛, 应 滕, 骆永明 申请人:中国科学院南京土壤研究所