本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫检测抗蛋白酶3抗体IgG试剂盒及其制备方法。
背景技术：
蛋白酶3（Proteinase 3，PR3）是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29KDa 的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV型胶原等多种组织成分。蛋白酶3通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C1抑制剂失活。抗中性粒细胞胞浆抗体（Antineut—rophiIcytoplasmic antibody，ANCA）是韦格纳肉芽肿（Wegener’s granulomatosis，WG）患者的血清标志物，尤其是抗蛋白酶3抗体。
WG是一种特殊类型的坏死性肉芽肿性血管炎。抗中性粒细胞胞浆抗体是对WG最有诊断意义的自身抗体。过去WG的诊断主要是根据典型的临床表现和病史，但有些患者，尤其是限局性的患者很难诊断，病检是确诊WG的重要手段。但一次或单部位病检阴性并不能排除WG。目前的研究认为大部分WG患者的ANCA特异性靶抗原是PR3，抗PR3抗体与WG的诊断和疾病活动密切相关。胞浆型ANCA和抗PR3抗体对WG诊断意义有高度的敏感性和特异性。国外报道在活检证实为WG的患者中，抗PR3抗体特异性为90％以上。敏感性是与疾病的活动性有关。通常抗PR3抗体滴度与疾病活动一致，活动性WG患者在病变尚未影响到呼吸系统时抗PR3抗体敏感性是65%，当患者出现呼吸系统、肾脏损害时其灵敏度达90%以上。活动期滴度较高，部分缓解期滴度很低，完全缓解的患者多数测不到。缓解期抗PR3抗体滴度的升高可能预示着复发，并且有助于将感染和复发区分开。
临床检测抗蛋白酶3抗体IgG的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述的不足之处：
（1） 使用12×8 型、6×8 型、8×12 型或整板型96 孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；
（2） 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；
（3） 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；
（4） 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；
（5） 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；
（6） 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96 人份，如果需要检测10 个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96 人份，如果只有一份样本需要检测10 个不同的项目，也需要配置10×48/96 人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
技术实现要素：
目前抗蛋白酶3抗体IgG检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。
本发明正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单的抗蛋白酶3抗体IgG试剂盒及其制备方法。本发明首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括：蛋白酶3抗原包被的磁颗粒、鼠抗人IgG单克隆抗体包被的吖啶酯以及抗蛋白酶3抗体IgG定标品；然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对抗蛋白酶3抗体IgG全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。
本发明与目前技术相比，具有以下优点：
1、本发明选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到1AU/mL，相比其它的抗蛋白酶3抗体IgG检测方法灵敏度至少提高了10倍；
3、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到3-400AU/mL，其它的抗蛋白酶3抗体IgG化学发检测方法的检线性范围为20-135AU/mL；
4、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
5、本发明的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
6、本发明的化学发光免疫分析系统已实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
附图说明
图1为实施例3得到的抗蛋白酶3抗体IgG标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：抗蛋白酶3抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒制备方法
（1）蛋白酶3抗原包被的纳米磁珠制备：
取50mg羧基化的磁微粒（粒径为0.05-1um）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5 MES缓冲液重悬，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 蛋白酶3抗原，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到蛋白酶3抗原包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（2）鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯的制备：
取50 uL 25mg/mL的鼠抗人IgG单克隆抗体，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2 h后取出，用2 mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯，每瓶5 mL分装保存于4℃备用。
（3）抗蛋白酶3抗体IgG定标品的制备：
用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）将抗蛋白酶3抗体IgG配置成浓度为0 AU/mL、5 AU/mL、20 AU/mL、50AU/mL、90AU/mL、165 AU/mL，每瓶0.5 mL分装冻干，4 ℃保存备用。
(4)化学发光预激发液的配制：
量取1.0升纯化水，依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、1.0克叠氮化钠、1.5克吐温20，摇匀后避光存放。
(5)化学发光激发液的配制：
量取1.0升纯化水，依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克Triton 405，摇匀后避光存放。
实施例2：抗蛋白酶3抗体IgG化学发光免疫检测方法：
本发明以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为间接法，即仪器依次加入5uL的样品、95uL样本稀释液、50 uL的蛋白酶3抗原包被的磁颗粒反应10 min后，进行磁分离。加入100uL的鼠抗人IgG单克隆抗体包被的吖啶酯，反应10 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入100uL化学发光预激发液、200uL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的 抗蛋白酶3抗体IgG含量。
实施例3：抗蛋白酶3抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒性能评价
检测曲线见附图1。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案，计算抗蛋白酶3抗体IgG化学发光免疫层析试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为1AU/ mL。
线性的检测：
对浓度为5 AU /mL、20 AU /mL、50 AU /mL、90 AU /mL、165 AU /mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r=0.9996，另外，该试剂盒对抗蛋白酶3抗体IgG样品检测的线性范围为3-300AU /mL。
精密度测定：
取浓度为2 AU /mL及100 AU mL两个抗蛋白酶3抗体IgG样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件标准，可用于临床实验室维生素 D 状况的准确评估。
实施例4:抗蛋白酶3抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度对比实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0 AU /mL的校准品或样本稀释液为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M-2SD，将该发光值代入校准曲线计算得到相应的浓度值。采用化学发光检测方法得到的浓度值为1.0 AU /ml，相对于传统的酶联免疫吸附法最低检测限8.2 AU /ml，提高了约8倍。