本发明属于生物医学技术领域，涉及一种甲状旁腺激素定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
甲状旁腺激素（pth）是由甲状旁腺主细胞分泌的84个氨基酸组成的单链多肽，贮存于胞质分泌颗粒或微泡中。分子中不含胱氨酸和酪氨酸，分子量约为9.5kd，其编码基因定位于11号染色体的短臂上，甲状旁腺激素是生物体内调节钙、磷代谢的重要激素之一，在调节生物体骨代谢中发挥重要作用。
甲状旁腺激素作为一种尿毒症毒素，可引起多种器官损伤，如肾性骨病，也脏肥大，软化等，因此，甲状旁腺激素检测可用于辅助诊断各种原因导致的甲状旁腺功能亢进与减退，高、低巧血症的病因及区分是否与甲状旁腺有关。同时，甲状旁腺激素检测是临床上诊断，检測肾性骨病的重要手段。pth水平也可用来监测甲状旁腺肿瘤术后或其他治疗的疗效。
甲状旁腺激素的检测伴随标记免疫技术的发展经历了以下几个阶段。上世纪60年代，第一代检测方法采用放射竞争免疫法测定，所用的抗体主要是针对pth免疫源性较强的中间段或羧基端，检测的物质为完整pth分子和羧基端片段的总和，检测结果假性偏高，特别是在肾衰竭患者中羧基端片段浓度较高时，检测结果与临床相关性较差，不能反映肾性骨病的真实状态。随着免疫检测技术的进步，20世纪80年代免疫放射定量检测法定量检测甲状旁腺激素的方法应运而生，采用双抗体夹也法、酶免免疫法、化学发光法或者电化学发光法进行检测，其特点为两个抗体分别结合pth的氨基端和羧基端，第二代检测方法的检测特异性和灵敏度较第一代有了大幅的提升。如scantibodies公司研发的整分子甲状旁腺激素检测试剂盒，一个多抗结合位点位于1-34为氨基端之间，另一个多抗结合位点位于39-84氨基酸之间；而罗氏公司的电化学发光试剂盒采用的两个抗体的结合位点则分别定位于26-32和55-64位氨基酸之间。此后较长的一段时间内，这种＂双抗体夹心＂的检测方法一直被认为检测的目标物是整分子甲状旁腺激素，即pth（1-84）。但是研究结果表明，第二代检测方法测得的结果与骨活检的结果不相符，后期研究逐渐证实终末期肾病患者测得的结果易出现偏高的情况。后续的研究表明，与整分子pth不同的是，pth（7-84）不能激活腺苷酸环化酶，被称为cpi，而整分子pth，即pth（1-84）具有激活腺巧酸环化酶的活化被称为cap，这也解释了为什么第二代甲状旁腺激素检测在esrd患者人群中检测结果与骨活检结果不相符。2000年后，研究人员经过努力开发出了结合位点定位于pth前６个氨基酸残基的抗体，使得只检测整分子的pth，即pth（1-84）成为可能，被称为＂第三代＂pth检测或者被制造商命名为＂生物活性完整ｐｔｈ检测。但是第三代pth在临床检验中不常使用，研究表明，在健康人群和慢性肾病人群中第二代和第三代pth检测结果有很好的相关性，但是第三代pth检测结果相对第二代pth检测偏低40-50%，专家推荐在更确定的骨活检证据发布前仍然采用第二代pth检测用于正常人和慢性肾脏疾病病人的评价。
目前国内临床检验广泛使用的pth诊断试剂均为前述第二代pth检测方法，基本为国际诊断巨头所垄断（据sfda），国际诊断巨头均为全自动、封闭式、磁微粒化学发光诊断系统，价格高昂，是导致我国看病贵的难题的原因之一，一定程度上限制了我国检验和卫生事业的发展。国内仅有1个厂家注册有pth半自动诊断试剂，未得到临床检验的认可和广泛使用。临床迫切需求成本经济、质量可靠的国产诊断试剂。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种甲状旁腺激素定量检测试剂盒。本发明甲状旁腺激素定量检测试剂盒具有反应速度快，反应时间短、成本低等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为。
一种甲状旁腺激素定量检测试剂盒，包括包被有甲状旁腺激素片段抗原pth（39-84）的单克隆抗体的磁微粒混悬液、甲状旁腺激素系列校准品、辣根过氧化物酶标记的甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体、发光底物a液、发光底物b液及洗液。
所述磁微粒混悬液的磁微粒固相抗体的包被浓度为0.3μg/t。
所述甲状旁腺激素系列校准品是采用ph为7.4的tris稀释液基质，加入甲状旁腺激素who标准品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而成。
所述稳定剂为edta稳定剂。
所述辣根过氧化物酶标记的甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体采用的标记方法为过碘酸钠氧化法。
所述洗液为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
一种甲状旁腺激素定量检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
第一步，包被有甲状旁腺激素片段抗原pth（39-84）的单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
根据使用量取羧基磁微粒，用过量的edc和nhs再酸性条件下进行活化，活化完成后，加磁场，静置是磁微粒与液体分开，弃去上清，用ph为7.6的0.01m的pbs缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂；加入甲状旁腺激素片段抗原pth（39-84）的单克隆抗体，使其浓度为0.3μg/t，在酸性条件下振荡反应；反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%牛血清白蛋白的0.01m的pbs缓冲液进行封闭，并加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0.5mg/ml；将该磁微粒混悬液置于2-8度保存，以备使用；
第二步，甲状旁腺激素系列校准品的制备
用ph7.40.5mtris缓冲液加入1%牛血清白蛋白，再加入1%浓度的edta稳定剂配成校准品稀释液，甲状旁腺激素who标准品用上述稀释液配制成标示浓度为的3000pg/ml、1000pg/ml、250pg/ml、50pg/ml、10pg/ml的一系列校准品；
第三步，辣根过氧化物酶标记的甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体的制备
（1）醛化酶溶液的制备
秤取5mghrp加入0.5mlph为5.6的0.2mhacb溶解后，加入0.06m过碘酸钠溶液0.5ml，4℃氧化15-30min，加乙二醇-氯化钠溶液0.5ml，室温作用20-30min，加入无水乙醇6.0ml混匀，1200-1500rpm离心10-15min左右，加水2.5ml溶解沉淀，即得醛化酶溶液，其浓度约为1mg醛化酶/0.5ml；
（2）醛化酶与抗体结合
将甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体加入醛化酶溶液中，再加入0.5mph9.6的碳酸盐缓冲液调节ph至8-9，于4-5℃，12-14h，加等量甘油混合后于-10度保存备用。
本发明的有益效果：
（1）本项研究的经济、社会效益在于开发出成本经济、性能优良的国产全自动磁微粒化学发光ｐｔｈ诊断试剂，配合全自动化学发光仪使用，为临床检验提供替代进口试剂、仪器的ｐｔｈ检测解决方案。通过实验室研究和略床应用前评价考查开发的试剂的性能指掠和与进口试剂对比的情况。递交ｓｆｄａ注册、最终应用于临床检验领域，一定程度上满足临床检验发展的需求。
（2）本项研究开发完成的甲状旁腺激素试剂盒（磁微粒化学发光法）是基于酶联免疫分析技术和磁微粒化学发光检测技术建立的检测体系，检测所用的两个单克隆抗体分别针对甲状旁腺激素的簇基端和氨基端，属于第二代甲状旁腺激素检测方法。试剂盒应用夹也法，在磁性微粒上包被抗－ｐｔｈ抗体，这种磁微粒为纳米级的磁性小微粒，具有表面积大，易于分离等特点，在理论上有加快反应速度，缩短反应时间等优点。
附图说明
图1是本发明的考核试剂盒与对比试剂盒对照图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所述的甲状旁腺激素定量检测试剂盒，包括包被有甲状旁腺激素片段抗原pth（39-84）的单克隆抗体的磁微粒混悬液，磁微粒固相抗体的包被浓度为0.3μg/t；甲状旁腺激素系列校准品采用ph为7.4的tris稀释液基质，加入甲状旁腺激素who标准品、牛血清白蛋白及edta稳定剂配制而成；辣根过氧化物酶标记的甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体采用的标记方法为过碘酸钠氧化法；发光底物a液、发光底物b液及洗液。
本发明的甲状旁腺激素定量检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
第一步，包被有甲状旁腺激素片段抗原pth（39-84）的单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
根据使用量取羧基磁微粒，用过量的edc和nhs再酸性条件下进行活化，活化完成后，加磁场，静置是磁微粒与液体分开，弃去上清，用ph为7.6的0.01m的pbs缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂；加入甲状旁腺激素片段抗原pth（39-84）的单克隆抗体，使其浓度为0.3μg/t，在酸性条件下振荡反应；反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%牛血清白蛋白的0.01m的pbs缓冲液进行封闭，并加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0.5mg/ml；将该磁微粒混悬液置于2-8度保存，以备使用；
第二步，甲状旁腺激素系列校准品的制备
用ph7.40.5mtris缓冲液加入1%牛血清白蛋白，再加入1%浓度的edta稳定剂配成校准品稀释液，甲状旁腺激素who标准品用上述稀释液配制成标示浓度为的3000pg/ml、1000pg/ml、250pg/ml、50pg/ml、10pg/ml的一系列校准品；
第三步，辣根过氧化物酶标记的甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体的制备
（1）醛化酶溶液的制备
秤取5mghrp加入0.5mlph为5.6的0.2mhacb溶解后，加入0.06m过碘酸钠溶液0.5ml，4℃氧化15-30min，加乙二醇-氯化钠溶液0.5ml，室温作用20-30min，加入无水乙醇6.0ml混匀，1200-1500rpm离心10-15min左右，加水2.5ml溶解沉淀，即得醛化酶溶液，其浓度约为1mg醛化酶/0.5ml；
（2）醛化酶与抗体结合
将甲状旁腺激素片段抗原pth（1-34）的单克隆抗体加入醛化酶溶液中，再加入0.5mph9.6的碳酸盐缓冲液调节ph至8-9，于4-5℃，12-14h，加等量甘油混合后于-10度保存备用。
本发明的甲状旁腺激素定量检测试剂盒的使用操作程序如下：
1、样本的采集和处理
采集：采用正确医用技术收集全血标本，37℃静置１h，离心分离提血清或血浆１小时后用于检测。试验中血清样本不加防腐剂等添加剂。
储存；对于采集后24h内需要检测的样本可放置2-8℃保存，如果需要长时间存放应该放置-20℃保存，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。若标本有沉淀物，应离心除去，并确定未变质方可使用。严重溶血或脂血标本不能使用。
2、反应步骤
甲状旁腺激素定量检测试剂盒（磁微粒化学发光法）的反应原理是双抗体夹心法，连接至固相磁微粒上的抗甲状旁腺激素特异位点的单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记的抗甲状旁腺激素另一特异位点的单克隆抗体与血清中存在的甲状旁腺激素结合，形成夹心复合物，经过洗洛后加入发光底物，最终留在固相磁微粒上的辣根过氧化物酶催化发光底物产生的发光值与血清中甲状旁腺激素的含量成正比例。本试剂盒的反应步骤确定为先在反应孔中加入样本，然后磁微粒混悬液，最后加入酶结合物，震荡混匀后放置37℃条件下反应，所有的加样、温浴、洗涂、检测等操作由全自动化学发光免疫检测仪autolumoa2000自动完成。
3、实验前准备
①取1瓶浓缩洗液按标签上标识的稀释比例要求稀释备用。②将恒温箱或水浴锅温度调至37℃，待温度稳定后使用。③将磁微粒混悬液充分混匀至无肉眼可见沉淀。
4、实验方法
①取出一定量的反应容器，编号。根据实验要求加入50μl校准品/质控品/临床血清。
②摇匀磁微粒混悬液，每孔分别加入20μl。
③每孔分别加入酶标记物50μl。
④将反应容器内溶液混合均匀，37℃温育15分钟。
⑤使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液洗涤5次。
⑥将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
⑦每孔加入发光底物a和发光底物b各50μl，振荡混匀后避光室温反应5分钟。
⑧化学发光检测仪检测发光强度。
本发明甲状旁腺激素定量检测试剂盒的方法学鉴定结果：
按照上述操作方法对该试剂盒进行方法学鉴定，该试剂盒可达到如下指标：
最低检出限：小于0.005μiu/ml精密性：分析内变异、分析间变异及批间变异均小于10％(见表1)
表1.精密性数据表
a)、分析内和分析间变异数据表。
本发明的考核试剂盒与对比试剂盒对照：本发明的试剂盒和某国际知名体外诊断试剂公司生产的甲状旁腺激素测定试剂盒（化学发光法）同时对214份临床血清样本进行测定，二者测定结果的相关性较好，相关系数r为0.988(如图1所示)。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。