本发明属于免疫检测分析领域，具体是一种e-选择素的免疫化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
e-选择素（es）被称为“内皮细胞白细胞黏附分子”（el-am-1），现已被统一命名为es或cd62e。es与选择素家族的其他成员相同，是一型单链糖蛋白，相对分子质量为115x103，由一系列蛋白区域片段构成，其中包括氨基末端c型植物凝集素（leotin）因子样片段、一个表皮生长因子（egf）样片段、6个较短共同重复序列（scr）（或补体调节/结合蛋白重复序列，每个序列约含60个氨基酸）、单一跨膜区域和一个胞浆区。与其他选择素相比，es的主要结构特点为：补体调节型的多个重复序列与凝集素和egf区城结合，每个补体调节重复片段含6个而不是4个半胱氨酸。es凝集素区域与甘露糖结合蛋白紧密排列，c型凝集区域和egf区域具有高度的保守性，使其在与配体结合方面有重要作用。
炎症在冠状动脉粥样硬化的发生、发展中的作用越来越受到人们的重视，慢性炎性反应促进了动脉粥样硬化的进展。与冠状动脉粥样硬化形成有密切关系的细胞黏附分子主要有选择素家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族。es是选择素家族的一员，是在炎症过程中最初出现的黏附分子。es的作用是减慢血流中的白细胞流动，使其滚动到血管内皮表面，然后使整合素家族与其配体细胞间黏附分子-1（icam-1）或es结合，使白细胞紧密黏附于内皮表面，并介导白细跑的渗出，而白细胞向血管内皮的迁移黏附是动脉粥样硬化的重要机制。冠心病患者血清可溶性es表达增加，es可能参与了冠心病的发病过程与冠状动脉粥样硬化的形成。所以我们对es的检测有助于判断心绞痛患者及冠状动脉中斑块的稳定性。
目前e-选择素检测的方法有：酶联免疫法等。酶联免疫法采用的酶为辣根过氧化物酶，采用辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被h2o2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。本发明采用吖啶酯标记，具有如下优点：①背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；②闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，提高系统整体灵敏度；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定，不受环境氧化剂的影响(在2-8℃下可保存数月之久)。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。
本发明采用的方法为化学发光法，其优点为：灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、线性范围宽，检测结果具有更高的准确性与重复性。
技术实现要素：
本发明提供了一种具有较高灵敏度和特异性的检测e-选择素的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种e-选择素的化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的化学发光法检测e-选择素的试剂盒，采取磁微粒偶联e-选择素（es）捕获抗体，吖啶酯标记e-选择素（es）检测抗体。试剂盒还包括e-选择素校准品、化学发光预激发液a、化学发光激发液b以及清洗液。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与e-选择素抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记e-选择素抗体。
作为本发明进一步的方案，所述磁珠的表面修饰基团为羧基、氨基、链霉亲和素-生物素或对甲苯磺酰基。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，沉降速度慢的磁珠。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如：nsp-dmae-nhs、nsp-sa-nhs等。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是e-选择素（es）检测抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记e-选择素（es）检测抗体的缓冲液是ph8.0-11.0、浓度为0.01-0.20mol/l的na2co3-nahco3缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯与抗体的摩尔比为5-100:1。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯溶于dmso或dmf中，且所配制溶液的最终浓度为0.1-100mmol/l。
作为本发明进一步的方案，所述的检测抗体和捕获抗体均是e-选择素（es）单克隆抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0%bsa的tris或pbs或hepes缓冲液为基质，加入e-选择素纯品配置而成。
作为本发明进一步的方案，所述的e-选择素校准品溶液浓度分别为0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、80ng/ml、320ng/ml、1280ng/ml。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光预激发液a为h2o2和hno3的混合液，其中h2o2质量分数为0.01-5.0%，hno3浓度为0.01-1.0mol/l。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光激发液b为tritonx-100和naoh的混合液，其中tritonx-100的质量分数为0.01-2.0%，naoh的浓度为0.05-1.0mol/l。
作为本发明进一步的方案，所述的清洗液包括以下组分：ph值7.0-9.0、浓度为5.0-50.0mmol/l的tris或hepes或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的tween-20。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子检测产物浓度。
本发明的优点在于采用夹心法联合磁微粒化学发光技术以测定e-选择素的含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
具体实施方式
本发明提供了一种e-选择素的化学发光检测试剂盒，为使本发明目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进行详细说明。
本发明提供一种e-选择素的化学发光检测试剂盒及制备方法，磁微粒偶联的e-选择素（es）捕获抗体、吖啶酯标记的e-选择素（es）检测抗体。试剂盒还包括e-选择素校准品、化学发光预激发液a、化学发光激发液b以及清洗液。
具体地，本发明在制备磁微粒偶联捕获抗体的过程中，所述偶联抗体的缓冲液为ph值5.0-6.0、浓度为20-200mmol/lmes的缓冲液。
具体地，本发明在制备磁微粒偶联捕获抗体的过程中，所述封闭缓冲液为含1%bsa的缓冲液。
具体地，本发明在制备吖啶酯标记检测抗体的过程中，所述的吖啶酯标记e-选择素（es）检测抗体的缓冲液是ph8.0-11.0、浓度为0.01-0.20mol/l的na2co3-nahco3缓冲液。
具体地，本发明所述校准品是由含有0.5-5.0%bsa的tris或pbs或hepes缓冲液为基质，加入e-选择素纯品配置而成。
具体地，所述的化学发光预激发液a为h2o2和hno3的混合液，其中h2o2质量分数为0.01-5.0%，hno3浓度为0.01-1.0mol/l。
具体地，本发明所述化学发光激发液b为tritonx-100和naoh的混合液，其中tritonx-100的质量分数为0.01-2.0%，naoh的浓度为0.05-1.0mol/l。
具体地，本发明所述清洗液为ph值7.0-9.0、浓度为5.0-50.0mmol/l的tris或hepes或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的tween-20。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：一种e-选择素的化学发光检测试剂盒的组建及制备方法
1.试剂盒的组建
磁微粒偶联的e-选择素单克隆抗体；
吖啶酯标记的e-选择素（es）单克隆抗体；
e-选择素系列校准品溶液；
化学发光预激发液a和化学发光激发液b；
清洗液。
2.偶联e-选择素单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1mg羧基磁微粒于0.5ml离心管中，加入200μl浓度为0.1mol/l的mes缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200μl的mes（ph为6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15μge-选择素单克隆抗体，使羧基与抗体的摩尔比为150:1，涡旋，旋转反应管，室温孵育30min。
（3）加入10μl浓度为10mg/ml的偶联试剂edc，于旋转反应器上涡旋，室温孵育2h。
（4）取200μl含1%bsa的甘氨酸缓冲液（浓度为50mmol/l）进行封闭，时间为1h。
（5）去上清，加入200μl的清洗缓冲液（tbs+0.05%tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500μl的保存液（300mmol/l的甘氨酸、2%的甘油、5%的蔗糖）中，2-8℃保存。
3.吖啶酯标记e-选择素（es）单克隆抗体的制备
（1）纯化e-选择素（es）抗体：将100μg的e-选择素（es）抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1l的标记缓冲液中透析，期间缓冲液更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是ph9.8、浓度为50mmol/l的na2co3-nahco3缓冲液。
（2）称取1.7mg的吖啶酯nsp-dmae-nhs，溶于447μl无水二甲基甲酰胺（dmf）中，配成6.5mmol/l的nsp-dmae-nhsdmf溶液。
（3）将透析后的e-选择素（es）单克隆抗体置于500μl离心管内，加入200μlph9.8、浓度为50mmol/l的na2co3-nahco3的缓冲液（避光反应），加入759μl，6.5mmol/l的nsp-dmae-nhsdmf溶液，使吖啶酯与e-选择素（es）单克隆抗体的摩尔比值为7.4:1，振荡混匀，室温下反应1h，加入100μl浓度为10g/l赖氨酸，静置15min，使标记反应终止。
（4）标记物nsp-dmae-nhs-ab与游离nsp-dmae-nhs通过sephadexg-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液ph6.3、浓度为0.1mol/l的pbs平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1%bsa后分装冰冻保存。
4.e-选择素系列校准品溶液的制备
用含有1%bsa的tris-hcl缓冲液为基质，加入e-选择素纯品配成标示浓度分别为：0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、80ng/ml、320ng/ml、1280ng/ml的溶液。
5.发光激发液a、b的制备
（1）化学发光预激发液a由h2o2和hno3组成。其中，其中h2o2的质量分数为1.5%，hno3的浓度为0.1mol/l，用棕色瓶分装成20ml/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液b由tritonx-100和naoh的混合液组成。其中，tritonx-100的质量分数为1.0%，naoh的浓度为0.4mol/l，用棕色瓶分装成20ml/支，2-8℃保存备用。
6.清洗液的制备
称量3.05gtris，8.775gnacl至1000ml的烧杯中，加入1ml质量分数为0.05%tween-20，搅拌混匀，定容，将ph调至7.6后保存备用。
实施例2：用试剂盒检测与结果分析
（1）在反应杯中加入待测样本50μl，再加入磁颗粒偶联悬浮液150μl，振荡混匀，37℃孵育8min。
（2）分离，清洗3次。将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。。
（3）向反应杯中加入吖啶酯标记物150μl，振荡混匀，37℃孵育7min。
（4）分离，清洗3次。将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（5）加入100μl化学发光预激发液a，1s后加入100μl化学发光激发液b，测量其相对发光强度，样本中e-选择素的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例3：试剂盒的性能指标
1.试剂盒的灵敏度
用试剂盒中0ng/ml校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的rlu值（相对发光值），计算其平均值（m）和标准差（sd），得出m+2sd所对应rlu值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-rlu值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m+2sd的rlu值带入上述方程中，求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，最后求出本试剂盒对e-选择素的分析灵敏度为4ng/ml。
2.精密度测定
用es试剂盒测试浓度为(12±1.2)ng/ml和(45±4.5)ng/ml的样本，每个浓度重复测试10次，计算试剂盒精密度，结果表明该试剂盒cv均小于5%。
3.稳定性
取e-选择素检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示e-选择素检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。