一种饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法与流程

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法。
背景技术：
：随着畜牧业的发展，兽药在畜牧业中的运用显著增加。由于抗菌谱广，四环素类抗生素是我国畜牧业中生产量和使用量最多的一种抗生素，被广泛作为饲料中的药物添加剂，用于治疗动物疾病和促进动物生长。在畜牧养殖业中四环素类药物的滥用和不遵从停药期规定可导致药物残留，沉积于骨骼及牙组织内，与新形成的骨、牙中所沉积的钙相结合，导致牙齿持久成黄色，俗称“四环素牙”，使出生的幼儿乳牙釉质发育不全并出现黄色沉积，引起畸形或生长抑制。四环素类药物还在肝组织中富集，造成肝损害，还可造成过敏反应、二重感染、致畸胎作用，四环素药物残留易诱导耐药菌株，同时造成的食品残留也给人们身体健康带来隐患。四环素类抗生素化学性质不稳定，在酸碱等条件下易发生变性反应，形成差向异构体，反应是可逆的，平衡时差向异构体的比例可达40％～60％。多数异构体的药效极低或消失，但毒性增加，己证实差向四环素对小鼠的静脉毒性是四环素的2～3倍，己被欧盟确定为残留标示物，因此对四环素类药物的异构体进行检测也是非常重要和必要的。目前国内外对四环素类药物残留问题十分关注，在饲料预警快速筛查中检出土霉素、金霉素和差向金霉素，其中土霉素、金霉素超出50mg/kg的饲料允许添加范围，依据中华人民共和国农业部公告第168号《饲料药物添加剂使用规范》规定。迄今为止，国内外的研究多集中于四环素类抗生素的检测，而关于同时检测四环素类药物及其异构体的报道很少，还没有相关饲料中四环素类药物及其异构体的残留量检测方法。中国发明专利申请(申请号：200910099611.5)公开了“同时测量蜂王浆中多种四环素类药物残留量的检测方法”，该方法中，前处理方法复杂，步骤繁琐，试剂用量大，不利于绿色环保。本发明的特点是检测方法简单、快捷、绿色环保，用最简单的提取方法，最少的试剂用量，达到最佳的结果，便于推广应用。技术实现要素：本发明的目的是为解决饲料中四环素类抗生素及其异构体检测没有现行检测方法问题，提供一种利用液相色谱-串联质谱仪检测饲料中四环素类药物及其异构体的方法。本发明为实现上述目的，采取的技术方案如下：一种饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤一：称取待测样品加入提取液Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液和乙酸铅水溶液涡动混匀，震荡，离心，取出上清液，备用；步骤二：用甲醇、超纯水活化PRiMEHLB固相萃取小柱，上清液过柱，用甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干；甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后，再用甲醇水溶液溶解残渣，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；步骤三：高效液相色谱-串联质谱仪的测定，液相色谱选用C18柱，采用0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水体系，梯度洗脱，质谱条件采用正离子模式下进行多反应监测。上述步骤一中Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液PH值为4.0～6.5，优选PH值为5.0。上述步骤一中蛋白沉淀剂有乙酸锌水溶液、乙酸铅水溶液、乙酸铵溶液、三氯乙酸溶液、甲醇、乙腈和冰乙酸水溶液，优选乙酸铅水溶液。上述步骤二中优选固相萃取小柱为PRiMEHLB60mg，3mL。上述步骤二中淋洗液为10％乙腈水溶液、10％甲醇水溶液、5％乙腈水溶液和5％甲醇水溶液淋洗液，优选5％甲醇水溶液。上述步骤二中溶解残渣的溶液为甲醇-0.1％甲酸/水溶液(5∶95，V/V)、甲醇水溶液(8∶2，V/V)和甲醇水溶液(5∶5，V/V)，优选甲醇水溶液(5∶5，V/V)。上述步骤三优选的液相色谱条件为色谱柱WatersBEHC18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相为A：0.1％甲酸乙腈和B：0.1％甲酸水；梯度洗脱程序如下：0～0.5min，A5％，B95％0.5～2.5min，A5％～20％，B95％～80％2.5～4.3min，A20％～95％，B80％～5％4.3～5.3min，A95％～5％，B5％～95％流速为0.3mL/min；进样量10μL；优选的质谱条件为电喷雾正离子电离ESI(+)；多反应监测扫描(MRM)；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50psi；气帘气压力：30psi；辅助气流速：60psi；离子源温度：500℃；辅助气流速：60psi；离子源温度：500℃；碰撞气：Medium。本发明相对于现有技术的有益效果是：本发明的检测方法简单、快捷、绿色环保，用最简单的提取方法，最少的试剂用量，达到最佳的结果。特异性强、灵敏度高、重现性好、且快速准确，只需进行一次前处理便可同时检测饲料中6种四环素类药物及其异构体。附图说明图1为饲料基质匹配四环素类药物及其异构体标准溶液特征离子质量色谱图(5.0μg/kg)；图2为空白饲料特征离子质量色谱图；图3为空白饲料添加四环素类药物及其异构体试样特征离子质量色谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。具体实施方式一：一种饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤一：称取待测样品加入提取液Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液和乙酸铅水溶液(为蛋白沉淀剂)涡动混匀，震荡，离心，取出上清液，备用；步骤二：用甲醇、超纯水活化PRiMEHLB固相萃取小柱，上清液过柱，用甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干；甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后，再用甲醇水溶液溶解残渣，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；步骤三：高效液相色谱-串联质谱仪的测定，液相色谱选用C18柱，采用0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水体系，梯度洗脱，质谱条件采用正离子模式下进行多反应监测。具体实施方式二：具体实施方式一中所述的饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，步骤一中Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液PH值为4.0～6.5(优选PH值为5.0)。具体实施方式三：具体实施方式一中所述的饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，步骤二中选用固相萃取小柱PRiMEHLB60mg，3mL。具体实施方式四：具体实施方式一中所述的饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，步骤二中淋洗液选用的甲醇和水的混合体积比为5∶95。具体实施方式五：具体实施方式一中所述的饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，步骤二中溶解残渣的甲醇水溶液中甲醇和水的混合体积比为5∶5。具体实施方式六：具体实施方式一中所述的饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，步骤三中色谱柱为WatersBEHC18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)，其中，2.1指内径，50指柱长，1.7指粒度；流动相为A：0.1％甲酸乙腈和B：0.1％甲酸水；梯度洗脱程序如下：0～0.5min，A5％，B95％；0.5～2.5min，A5％～20％，B95％～80％；2.5～4.3min，A20％～95％，B80％～5％；4.3～5.3min，A95％～5％，B5％～95％；流速为0.3mL/min；进样量10μL；质谱条件为电喷雾正离子电离ESI(+)；多反应监测扫描(MRM)；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50psi；气帘气压力：30psi；辅助气流速：60psi；离子源温度：500℃；辅助气流速：60psi；离子源温度：500℃；碰撞气：Medium。具体实施方式七：具体实施方式一中所述的饲料中四环素类药物及其异构体的检测方法，四环素类药物分别为四环素、土霉素、金霉素，四环素类药物的异构体分别为差相四环素、差相土霉素、差相金霉素。实施例1：一、样品处理方法，包括如下步骤：步骤一：称取饲料样品2.00(±0.02)g于50mL离心管中，加入18mLNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液，加2mL2％乙酸铅水溶液涡动混匀，震荡30min，10000r/min离心10min，取出上清液，备用；步骤二：用3mL甲醇、3mL水活化PRiMEHLB固相萃取小柱取上清液5mL过柱，用3mL5％甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用氮气在40℃水浴吹干，用1.0mL甲醇水(V/V＝50/50)溶液溶解残渣，然后，使用过滤膜0.2μm过滤，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。二、液相色谱-质谱仪仪器条件为：1)色谱柱：BEHC18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)2)流动相梯度洗脱条件见表1表1流动相梯度洗脱条件时间min0.1％甲酸乙腈0.1％甲酸水0.05.095.00.55.095.01.520802.520803.395.05.04.395.05.04.45.095.05.35.095.03)流速：0.3mL/min4)进样量：10μL5)离子源：电喷雾离子源6)扫描方式：正离子扫描7)检测方式：多反应监测8)电喷雾电压(IS)：5500V9)雾化气压力：(GS1)：50psi10)气帘气压力：(CUR)：30psi11)辅助气流速：(GS2)：60psi12)离子源温度：500℃13)碰撞气(CAD)：Medium14)离子对、去簇电压(DP)及碰撞气能量(CE)见表2表2备注：*表示定量离子三、线性关系：四环素类混合标准工作曲线溶液是用空白基质添加混合标准溶液制备，样品中添加浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100μg/kg基质匹配系列混合标准溶液，在本发明方法确定的实验条件下进样，测定峰面积，以浓度X为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数，见表3。表3表达的是四环素类抗生素的标准曲线和相关系数化合物名称标准曲线方程相关系数土霉素y＝1.24×105x+2.00×1050.99977四环素y＝1.78×105x+2.39×1050.99945金霉素y＝3.77×104x+7.14×1040.99862差向土霉素y＝1.23×105x+2.00×1050.99958差向四环素y＝5.22×104x+6.53×1040.99973差向金霉素y＝2.96×104x+1.29×1040.99925四、回收率及精密度试验空白饲料样品中添加3个不同浓度的混合标准溶液，添加浓度分别为5.0、10.0、20.0μg/kg，按照样品处理方法制备样品溶液，回收率及精密度见表4。表4表示的是四环素类抗生素的回收率及精密度(n＝5)五、灵敏度试验：利用本发明的方法对土霉素、四环素、金霉素、差向土霉素、差向四环素或差向金霉素的检出限为5.0μg/kg，定量限为10.0μg/kg。当前第1页1 2 3