一种呋喃西林生物标识物5‑硝基‑2‑糠醛的内标检测方法与流程

本发明涉及一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的检测方法，特别涉及一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的内标检测方法。

背景技术：

硝基呋喃类药物的化学性质不稳定，尤其对光照等十分敏感，而且在生物体内代谢速率非常快，浓度半衰期从几小时到十几小时不等，动物喂药24小时之后体内基本检测不到硝基呋喃原形药的存在。因此，从饲料或用药动物体内检测硝基呋喃原形药是比较困难且不准确的，原药的残留量不足以反映真实的用药情况。然而，硝基呋喃的代谢产物与组织蛋白结合后在生物体内却可以长期存在，研究表明在停药56天后检测，动物体内仍然可以检测到稳定含量的代谢产残留物。一直以来，对硝基呋喃类抗生素的违禁检测，是通过对其生物标示残留物(如图)的测定。以检测呋喃西林的代谢物氨基脲(SEM)为例，在适当的酸性水解氛围下，与组织蛋白结合的SEM会重新游离出来。从检测的角度出发，SEM是一类小分子量化合物，对液相色谱常用的紫外和荧光检测器响应均不理想，因而加入2-硝基苯甲醛(2-NBA)作为衍生化试剂，衍生产物NBA-SEM经过分离纯化后，用UPLC/MS/MS分析，检测限可达欧盟法规要求的1μg/Kg。

目前针对呋喃西林违禁用药的检测方法主要有高效液相色谱与质谱、紫外、荧光检测器联用法、分光光度法，薄层色谱法以及免疫分析法等，基于氨基脲(SEM)为生物标示物的检测方法无法分辨“阳性”的SEM究竟来自于呋喃西林还是自然产生。这也使得沿用至今的SEM是否能够继续作为呋喃西林检测的标示物在业内引起了巨大争议。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的内标检测方法，以5-硝基-2-糠醛(NF)为检测对象，采用2,4-二硝基苯肼为衍生化试剂将目标物转化为稳定、检测器下响应灵敏的化合物，突破现有研究无法克服内源性等非呋喃西林源生物标示物产生的局限性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的内标检测方法，包括如下步骤：

(1)试剂配制

将100毫克DNPH溶解在1毫升浓盐酸中，然后用甲醇定容至100毫升的容量瓶里，制得浓度为1.0mg/mL的衍生化试剂溶液；

(2)衍生化及净化

称取1.0±0.1g的样品，放入50毫升的样品管内，加入10毫升盐酸、100μL衍生化试剂溶液、100μL内标物溶液，充分涡旋后，避光放置于60℃的水浴中衍生反应20分钟，随后6000转/min离心五分钟，取上清液经Oasis PRiME HLB固相萃取小柱净化后，得到的液体旋蒸至干后，残留物用1.0毫升的流动相复溶，超声溶解后用0.2μm的滤膜过滤，得待检测液供液相色谱串联质谱仪分析；

(3)UPLC-MS分析

待检测液经液相色谱串联质谱仪检测分析，内标法定量。

作为优选，步骤(1)中所述浓盐酸的浓度为12moL/L。

作为优选，步骤(2)中所述内标物溶液为PDAB溶液，内标物溶液的浓度为1.0μg/mL。

作为优选，步骤(2)中所述盐酸浓度为0.2mol/L。

作为优选，步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY CSHTM C₁₈柱，规格：100*2.1mm，1.7μm；进样量：10μL；流速：0.2mL/min；柱温为45℃；流动相设置为：A相超纯水，30％体积；B相为乙腈，70％体积；洗脱程序设置为等度洗脱：A保持30％不变，B保持70％不变。

作为优选，步骤(3)中质谱条件为：质谱设置为负离子模式，纯度99.39％的氮气为锥孔气，流速60L/h，纯度99.9999％的氩气为碰撞气，流速600L/h；毛细管电压：3.5KV，离子源温度120℃，汽化温度，380℃；NF-DNPH和PDAB-DNPH的母离子分别设置为m/z 320.0和m/z 328.1，子离子分别设置为m/z 273.3、161.2和m/z 294.9、147.0；碰撞能分别设置为15eV和28eV。

作为优选，步骤(3)中，内标法定量，绘制标准曲线时5-硝基-2-糠醛标准工作溶液的浓度设置为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL，5-硝基-2-糠醛标准工作溶液中PDAB浓度恒定为100ng/mL。

本发明的有益效果是：以5-硝基-2-糠醛(NF)为检测对象，采用2,4-二硝基苯肼为衍生化试剂将目标物转化为稳定、检测器下响应灵敏的化合物，突破现有研究无法克服内源性等非呋喃西林源生物标示物产生的局限性。

附图说明

图1为标准溶液中PDAB-DNPH的MRM色谱图(浓度100ng/mL)。

图2为标准溶液中NF-DNPH的MRM色谱图(浓度2ng/mL)。

图3为南美白对虾中PDAB-DNPH的MRM色谱图(浓度100ng/mL)。

图4为南美白对虾中PDAB-DNPH的MRM色谱图(浓度2ng/mL)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

PDAB：对二甲氨基苯甲醛。

实施例：

一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的内标检测方法，包括如下步骤：

(1)试剂配制

将100毫克DNPH(2,4-二硝基苯肼)溶解在1毫升浓盐酸(12M)中，然后用甲醇定容至100毫升的容量瓶里，制得浓度为1.0mg/mL的衍生化试剂溶液；

(2)衍生化及净化

称取1.0±0.1g的样品，放入50毫升的样品管内，加入10毫升盐酸(0.2mol/L)、100μL衍生化试剂溶液、100μL PDAB溶液(1.0μg/mL)，充分涡旋后，避光放置于60℃的水浴中衍生反应20分钟，随后6000转/min离心五分钟，取上清液经Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(Waters)净化后，得到的液体旋蒸至干后，残留物用1.0毫升的流动相(乙腈/水＝7/3，V/V)复溶，超声溶解后用0.2μm的滤膜过滤，得待检测液供液相色谱串联质谱仪分析；

(3)UPLC-MS分析

待检测液经液相色谱串联质谱仪检测分析，内标法定量；

色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY CSHTM C₁₈柱，规格：100*2.1mm，1.7μm；进样量：10μL；流速：0.2mL/min；柱温为45℃；流动相设置为：A相超纯水，30％体积；B相为乙腈，70％体积；洗脱程序设置为等度洗脱：A保持30％不变，B保持70％不变。

质谱条件为：质谱设置为负离子模式，纯度99.39％的氮气为锥孔气，流速60L/h，纯度99.9999％的氩气为碰撞气，流速600L/h；毛细管电压：3.5KV，离子源温度120℃，汽化温度，380℃；NF-DNPH和PDAB-DNPH的母离子分别设置为m/z 320.0和m/z 328.1，子离子分别设置为m/z 273.3、161.2和m/z 294.9、147.0；碰撞能分别设置为15eV和28eV。(4)方法的线性范围和检出限

NF和PDAB标准溶液配制：NF和PDAB分别用流动相(乙腈/水＝7/3，V/V)配制成浓度为0.1和1.0μg/mL的储备液。根据实际需要用流动相稀释成相应的标准溶液。

配制一系列不同浓度的NF标准工作溶液，0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL，其中PDAB浓度恒定为100ng/mL，经DNPH衍生和净化步骤(步骤2)，依次进样，分别以NF-DNPH的峰面积为纵坐标，以相应的浓度值为横坐标，作标准曲线，结果表明，NF-DNPH在0.5-1.0ng/mL浓度范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数R²大于0.995。

(5)长期稳定性和特异性

在两个月的时间内，将PDAB-DNPH内标标准溶液每隔两周分析一次，色谱峰面积的相对标准偏差小于5％，这表明PDAB-DNPH衍生物具备足够的稳定性，可以存放数月。用分析不同种类空白样品(鱼，蟹和虾)的方式考察衍生物的特异性。结果显示，检测目标物附近没有基质效应的干扰作用(图1-图4)。

研究表明，NF的加标回收率很低，尽管将前处理方法经过各种优化，回收率依然维持在50％以下，究其原因可能是NF化学性质不太稳定，具有光和空气敏感性。这也是以NF为目标物的检测方法报道极少的原因之一。以2,4二硝基苯肼为衍生化试剂，将NF转化成稳定的腙类化合物，解决了定性识别的问题，如果要定量测定NF的准确含量，方法学上需要NF的同位素内标物，而目前市面上并无相关的化合物研究和出售。本发明提出了一种定量检测NF的内标物，经过方法学的验证，对二甲氨基苯甲醛(PDAB)能够起到内标校正的作用，使NF的加标回收率达到90％左右，满足了定量测试的要求。

实际样品测定

采用本方法对水产品批发市场采购的15份南美白对虾和25份海捕的梭子蟹中的NF残留量进行测定，其中有3个样品中检出NF含量在0.5-1.5ng/g之间。

结论

本实验以PDAB为内标物、采用DNPH在酸性水溶液中衍生化，Oasis PRiME HLB固相萃取小柱净化等前处理方法提取净化，超高效液相色谱-串联质谱内标法测定水产品中痕量呋喃西林代谢物5-硝基-2-糠醛残留量。结果表明，本方法具有简便、灵敏、准确的有点，可以用于水产品中痕量呋喃西林代谢物的定性和定量分析。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。