慢性阻塞性肺疾病急性恶化期标志物联合检测卡的制作方法

本实用新型涉及的是体外诊断技术领域，具体是用于定量检测全程C-反应蛋白(CRP)、降钙素原（PCT）、N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）的一种诊断慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性恶化期标志物联合检测卡。该检测卡是可以通过检测患者血清、血浆或全血，从而对人体进行免疫分析的医学检验耗材。

背景技术：

C-反应蛋白（CRP)是一种急性相蛋白，且是在历史上首先被认识的急性相蛋白之一。其血清或血浆浓度的增加是由炎性细胞因子如IL-6释放所致，它几乎恒定不变地显示有炎症存在。由于C-反应蛋白通常在细菌感染后增高，而病毒感染时不增高，所以测定人血中CRP含量对于有鉴别细菌和病毒感染重要意义。

降钙素原（PCT）是由116个氨基酸组成的激素原，分子量大约为12.7kD。PCT由神经内分泌细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞）表达，经酶切分解为（未成熟）降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血中仅含有少量的PCT。细菌感染后PCT会明显升高。动物模型试验显示机体发生脓毒血症时，多组织均能表达PCT。PCT水平升高见于细菌性脓毒血症，尤其是重症脓毒血症和感染性休克。PCT可作为脓毒血症的预后指标，也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标。对于社区获得性呼吸道感染和空调诱导性肺炎患者，PCT可作为抗生素选择以及疗效判断的指标。

N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）是BNP激素原（proBNP）分裂后无活性的N端片段，主要在心肌细胞受到容量负荷和压力负荷增高时由左心室分泌。人血清和血浆中NT-proBNP的测定可作为一种对疑似患充血性心力衰竭个体的诊断和监测轻度心脏功能障碍的辅助手段，还可辅助评估罹患充血性心力衰竭患者的严重程度及急性冠状动脉综合征和充血性心力衰竭患者的危险等级，也可用于左室功能不全患者的治疗监测。

以胶体金为代表的层析技术已发展了20多年，目前仍然广泛应用，但由于只能用于定性或半定量的检测，难以满足临床检测指标定量化的要求；同时检测结果靠肉眼判断，特别是在检测结果呈弱阳性时，极易造成人为漏检现象，因此存在灵敏度较低等问题，需要进一步完善。而新型免疫层析技术如采用乳胶荧光微球标记的荧光免疫层析技术不存在胶体金需大量聚集才能显色的缺点，其以特有的光电磁信号放大系统提高检测灵敏度，减少样品的本底干扰，拥有传统标记物所无法比拟的优势。免疫层析技术正朝着定量、高灵敏度、多标记检测等方向发展。

荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，通过物理和化学等方法负载荧光物质，受激发光源刺激后激发出荧光的固体微粒。荧光微球以体表面积大，表面吸附能力强，稳定而高效的发光效率等优点，并且受外界条件如溶剂、热、电、磁等的影响比纯粹的荧光化合物要小，其作为一种新型的载体材料已广泛应用于生物医学领域。相比胶体金等传统标记物须大量聚集肉眼辨别，它的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限。为识别不同待测物，可通过标记不同颜色荧光素的微球结合特定单抗，实现多标记检测的目的。因此荧光微球作为标记物的免疫层析技术有较高的研究价值与前景。

而且现有技术中，现有各厂家检测卡通常都是单项目单卡（即一个检测卡中装置一个测试条进行一个项目检测）。面对急性病发患者逐项检查无疑是延长了治疗时间，也造成了资源的浪费。也有厂家将不同项目放在同一个检测卡的同一测试条检测，但由于抗体之间的互相干扰，分子量不同也决定了移行速率的不同。检测结果往往没有专条专项（即一个测试条一个项目）检测理想，特别是对于急性病发患者而言，检测结果的准确与否极为重要。

目前慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病率呈逐年增高趋势，是遍及全球的常见病和多发病。全程C-反应蛋白(CRP)/ 降钙素原（PCT）/ N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）这三种标志物在患者体内的变化，不仅能预示着疾病的发生还可以对患者进行治疗后的监测，以判断治疗方法的效果。逐项检测不仅浪费时间也浪费耗材，联合检测能够帮助医生更快更准确的判断这些疾病的变化。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本实用新型目的是在于提供一种诊断慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性恶化期标志物联合检测卡，所述的检测卡中包含三个检测项目的测试条，分别为全程C-反应蛋白(CRP)（荧光免疫层析法）测试条、降钙素原（PCT）（荧光免疫层析法）测试条、N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）测试条；每个测试条均为独立测试条；测试条排列顺序不限定。同时进行全程C-反应蛋白(CRP)/ 降钙素原（PCT）/ N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）三个项目的检测，以帮助医生实现快速、方便的对慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性恶化期患者进行诊断治疗。

本实用新型提供的慢性阻塞性肺疾病急性恶化期标志物联合检测卡，包括：卡托、全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡；

其中，卡托上设有三个检测卡卡槽，三个检测卡卡槽中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡；

所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡均包括检测卡上盖和卡槽板，卡槽板上设有测试条卡槽，检测卡上盖设有样品孔和显示窗；全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡的测试条卡槽中放置全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条，降钙素原荧光免疫层析法检测卡的测试条卡槽中放置降钙素原荧光免疫层析法测试条，N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的测试条卡槽中放置N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条；

全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条、降钙素原荧光免疫层析法测试条和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条均包括标记物垫、包被垫和吸收垫，标记物垫的一端搭接于包被垫的一端上，吸收垫的一端搭接于包被垫的另一端上；标记物垫上覆有标记物；包被垫上设有检测线和质控线；

所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的检测卡上盖与卡槽板卡合，样品孔显露出标记物垫，而显示窗显露出包被垫的检测线和质控线。

作为其中一优选实施方式，卡托包括：三棱柱形的卡托本体和所述卡托本体一端延伸形成的手柄，所述卡托本体的每个侧面均设有一个检测卡卡槽；所述卡托本体的三个侧面的检测卡卡槽中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡。

作为其中另一优选实施方式，卡托包括：六棱柱形的卡托本体和所述卡托本体一端延伸形成的手柄，

所述卡托本体具有六个侧面，其中，第一侧面平行于第四侧面，第二侧面平行于第五侧面，第三侧面平行于第六侧面，第一侧面、第三侧面和第五侧面均设有一个检测卡卡槽；三个所述检测卡卡槽中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡。其中，第二侧面、第四侧面和第六侧面均设有磁性条。

其中，所述标记物垫为玻璃纤维素膜，所述包被垫为硝酸纤维素膜，所述吸收垫为吸水纸。

其中，全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 180、降钙素原荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 135和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 135。

其中，全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条、降钙素原荧光免疫层析法测试条和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条的标记物垫长度为24mm，包被垫长度为25mm，吸收垫长度为26mm，标记物垫与包被垫的搭接段长度为3 mm，吸收垫与包被垫的搭接段长度为2 mm；检测线和质控线设于包被垫上的两个搭接段之间；标记物覆于标记物垫上，对应位于样品孔与标记物垫的搭接段之间。

其中，所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的样品孔的中心与其检测线之间的距离为7~9mm。

其中，所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的显示窗处设有覆盖显示窗的透明膜；全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条、降钙素原荧光免疫层析法测试条和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条还包括底板，所述包被垫、标记物垫和吸收垫均固定于所述底板上。

其中，所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的上盖的样品孔旁边设有对应的检测项目的条形码。

本实用新型具有以下有益效果：

1、通过项目组合对慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性恶化期患者进行诊断治疗；

2、通过项目组合防止医生遗漏检验项目；

3、组合项目操作更简单便捷，无论肉眼判读还是仪器判读都比传统的单卡单项更方便高效；

4、节省了仪器内检测器的配置，降低生产成本。

5、测试条区域独立，免疫层析过程中项目间没有任何影响，比在同一个测试条上实现多项目检测准确度要高。

6、测试条区域独立，检测卡上有项目标识，不易发生误判和混淆。

附图说明

图1是本实用新型的较佳实施例的慢性阻塞性肺疾病急性恶化期标志物联合检测卡的卡托的分解平面图。

图2是本实用新型的较佳实施例的慢性阻塞性肺疾病急性恶化期标志物联合检测卡的卡托的立体图；

图3是本实用新型的所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡或N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的结构示意图。

图4是本实用新型的所述全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条、降钙素原荧光免疫层析法测试条或N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。

结合图1~4所示，本实用新型的慢性阻塞性肺疾病急性恶化期标志物联合检测卡，包括：卡托1、全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡；

其中，卡托1上设有三个检测卡卡槽3，三个检测卡卡槽3中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡；

如图3所示，全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡均包括检测卡上盖6和卡槽板7，卡槽板7上设有测试条卡槽10，检测卡上盖6设有样品孔8和显示窗9；全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡的测试条卡槽中放置全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条，降钙素原荧光免疫层析法检测卡的测试条卡槽中放置降钙素原荧光免疫层析法测试条，N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的测试条卡槽中放置N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条；

如图4所示，全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条、降钙素原荧光免疫层析法测试条和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条均包括标记物垫15、包被垫14、吸收垫16和底板13，标记物垫15的一端搭接于包被垫14的一端上，吸收垫16的一端搭接于包被垫14的另一端上；标记物垫15上覆有标记物；包被垫14上设有检测线T和质控线C；包被垫14、标记物垫15和吸收垫16均固定于底板13上。

结合图3和4所示，全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的检测卡上盖6与卡槽板7卡合，样品孔8显露出标记物垫15，而显示窗9显露出包被垫14的检测线T和质控线C。显示窗9处设有覆盖显示窗9的透明膜12。

在本实用新型的一实施例中，卡托包括：三棱柱形的卡托本体和卡托本体一端延伸形成的手柄，卡托本体的每个侧面均设有一个检测卡卡槽；卡托本体的三个侧面的检测卡卡槽中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡。

如结合图1和2所示，在本实用新型的较佳实施方式中，卡托1包括：六棱柱形的卡托本体2和沿卡托本体2一端延伸形成的手柄4，

卡托本体2具有六个侧面，其中，第一侧面平行于第四侧面，第二侧面平行于第五侧面，第三侧面平行于第六侧面，第一侧面、第三侧面和第五侧面均设有一个检测卡卡槽3；三个所述检测卡卡槽3中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡。第二侧面、第四侧面和第六侧面均设有磁性条5。

标记物垫15为玻璃纤维素膜，包被垫14为硝酸纤维素膜，吸收垫16为吸水纸。全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 180、降钙素原荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 135和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 135。

全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条、降钙素原荧光免疫层析法测试条和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条的标记物垫15长度为24mm，包被垫14长度为25mm，吸收垫16长度为26mm，标记物垫15与包被垫14的搭接段长度为3 mm，吸收垫16与包被垫14的搭接段长度为2 mm；检测线T和质控线C设于包被垫14上的两个搭接段之间；标记物覆于标记物垫15上，对应位于样品孔8与标记物垫15的搭接段之间。

全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的样品孔8的中心与其检测线T之间的距离为7~9mm。

全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡的上盖的样品孔旁边设有对应的检测项目的条形码（图中未示出）。

具体地，本实用新型的慢性阻塞性肺疾病急性恶化期标志物联合检测卡的制造方法及测试原理，概述如下：

全程C-反应蛋白(CRP)（荧光免疫层析法）测试条：本测试条用一株鼠抗人CRP单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线包被，作为测试线，用羊抗兔多抗在硝酸纤维素膜上划线包被制成质控线。将另一株鼠抗人CRP单克隆抗体标记上乳胶荧光微球与兔IgG标记的乳胶荧光微球混匀后喷涂在玻璃纤维素膜上制备成标记物垫。硝酸纤维素膜靠近质控线的一端覆盖上吸收垫，靠近测试线的另一端覆盖标记物垫。往标记物垫上加入已经稀释好的标准品或待测血样，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与测试线和质控线反应。当测试结果有效时，质控线显示一定光强度。这时测试线上的光信号强度比质控线光信号强度的比值（T/C)与样本浓度成正相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。

降钙素原（PCT）（荧光免疫层析法）测试条：本测试条用一株鼠抗人PCT单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线包被，作为测试线，用羊抗兔多抗在硝酸纤维素膜上划线包被制成质控线。将另一株鼠抗人PCT单克隆抗体标记上乳胶荧光微球与兔IgG标记的乳胶荧光微球混匀后喷涂在玻璃纤维素膜上制备成标记物垫。硝酸纤维素膜靠近质控线的一端覆盖上吸收垫，靠近测试线的另一端覆盖标记物垫。往标记物垫上加入标准品或待测血样，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与测试线和质控线反应。当测试结果有效时，质控线显示一定光强度。这时测试线上的光信号强度比质控线光信号强度的比值（T/C)与样本浓度成正相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。

N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）（荧光免疫层析法）测试条：本测试条用一株鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线包被，作为测试线，用羊抗兔多抗在硝酸纤维素膜上划线包被制成质控线。将另一株鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体标记上乳胶荧光微球与兔IgG标记的乳胶荧光微球混匀后喷涂在玻璃纤维素膜上制备成标记物垫。硝酸纤维素膜靠近质控线的一端覆盖上吸收垫，靠近测试线的另一端覆盖标记物垫。往标记物垫上加入已经准备好的标准品或待测血样，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与测试线和质控线反应。当测试结果有效时，质控线显示一定光强度。这时测试线上的光信号强度比质控线光信号强度的比值（T/C)与样本浓度成正相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。

为使全程C-反应蛋白(CRP)（荧光免疫层析法）测试条、降钙素原（PCT）（荧光免疫层析法）测试条、N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）（荧光免疫层析法）测试条反应时间一致，采用玻璃纤维素膜作为标记物喷涂的标记物垫，由于三种标志物的分子量大小不同，层析速率也不同。如果使用同种规格的玻璃纤维素膜，样品与标记物结合后，到达测试线和质控线的时间不一致。先到达测试线和质控线的，先与包被抗体反应，一般标本在照射超过3min，就有荧光减弱现象，经乳胶荧光微球标记的标本最好及时观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。所以通过选择不同规格的玻璃纤维素膜(纤维结构的紧密程度不同)使反应时间达到一致，方便同时检测。全程C-反应蛋白荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 180、降钙素原荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 135和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法测试条的包被垫为硝酸纤维素膜Millipore 135。

因为包被垫处于显示窗下，是检测器检测的区域，所以极为重要，为防止显示窗下的包被垫在运输过程与干燥剂发生直接接触，因此在检测卡上覆盖一层四周有粘性的薄膜，不仅可以起到保护包被垫的作用还可以在检测滴加完试样后，重新贴上，避免外界干扰的作用。

考虑到三个检测卡并排排列进行检测，所需适用仪器需配置三个检测器，同时软件方面也要做些改进，检测方便的同时却增加了仪器成本。现设计一种卡托，可同时放置三种检测卡，此卡托呈三棱柱体结构，将三个项目的检测卡放入卡托中，再将卡托放入仪器，转动手柄，即可分别检测三个项目。

如图1所示，考虑到检测卡与卡托之间更为方便的操作，现将三棱柱体卡托设计成可以平铺样式，拿到检测卡即可以安装在卡托上，平铺时三个检测卡并排排列，排列顺序不限制，安装好后，撕开检测卡上的薄膜，进行加样，按说明书反应时间进行反应，当然为了防止外界环境因素的干扰，也可以再将薄膜重新盖上，等待其反应，反应好后，将平铺的卡托组成三棱柱体，撕掉薄膜(此时的薄膜也是为了防止操作过程中检测者不小心接触到显示窗区域) ，然后放入仪器进行检测。

考虑到安装好检测卡的卡托放入仪器后，检测卡要水平放置，仪器内的检测器才能准确的检测到显示窗区域的检测线和质控线，因此为了使转动卡托手柄时，每一个安装在三棱柱面的检测卡都能水平放置以被检测，特将三棱柱体的三条棱柱线设计成平面（即形成六棱柱），卡托本体2具有六个侧面，其中，第一侧面平行于第四侧面，第二侧面平行于第五侧面，第三侧面平行于第六侧面，第一侧面、第三侧面和第五侧面均设有一个检测卡卡槽3；三个所述检测卡卡槽3中分别嵌卡设置有全程C-反应蛋白荧光免疫层析法检测卡、降钙素原荧光免疫层析法检测卡和N-末端脑钠肽前体荧光免疫层析法检测卡。第二侧面、第四侧面和第六侧面均设有磁性条5。三条磁条线，同时仪器内检测器正下方为卡托，卡托正下方纵向放置一条水平的有磁性的细长磁性带。这样每转动一次，由于磁性的吸引，卡托上的三条磁性条5会与正下方的纵向磁性带相吸引，从而使检测卡水平放置。

参照图4，本具体实施方式采用以下技术方案，取PVC底板13，撕掉中间位置的油纸，将硝酸纤维素膜贴入中间位置，进行包被、干燥制成包被垫14。另取玻璃纤维素膜进行标记、干燥制成标记物垫15。取标记物垫15，撕掉PVC底板13靠近包被垫14测试线一侧的油纸，将标记物垫15贴在与包被垫14重合3mm的PVC底板上。取吸收垫16，撕掉PVC底板13靠近包被垫14质控线一侧的油纸，将吸收垫16贴在与包被垫14重合2mm的PVC底板上。按切条机标准操作规程进行操作，切成4mm±0.1mm宽的试纸条。

将切好的试纸条按要求安装到塑料卡壳的底壳上，然后扣好上壳。贴好薄膜后装在铝箔袋中加入干燥剂，封好口。

本具体实施方式实现了同一个检测卡上能够同时完成针对慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性恶化期的三个重要标志物的检测，可以帮助医生对慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性恶化期患者进行诊断，相比较单卡单测节省了时间，提高了检测效率。

以上所述实施例仅是为充分说明本实用新型而所举的较佳的实施例，本实用新型的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本实用新型基础上所作的等同替代或变换，均在本实用新型的保护范围之内。本实用新型的保护范围以权利要求书为准。