一种毛细力驱动的测试卡的制作方法

本发明涉及一种微流控芯片，特别涉及一种毛细力驱动的测试卡。

背景技术：

随着技术的进步和应用要求的不断提高，近些年来生化分析设备一直向小型化、集成化、自动化和并行处理的方向发展。希望通过减少昂贵的试剂用量来降低经济成本，通过减小分析仪器的特征尺寸来加速分析过程。例如，规模化、并行化的生物探针阵列，节省了大量试剂成本，加快了分析过程，它促使了人类基因组计划的提前完成。大型设备的制造、使用和维护复杂，而小型设备只需要处理微量样品，通过集成化的微流体网络，大大减少了流动控制的复杂程度。在这样的背景和需求下，微流控芯片技术应运而生。微流控芯片技术源于在20世纪80年代末和90年代初，Manz和Widmer等人提出的微全分析系统“Micro Total Analysis Systems,μ-TAS"，也叫“Lab-On-a-Chip,LOC”的概念。该技术将微加工技术和微流体技术有机地结合在一起，在方寸大小的芯片上集成了生化分析中的样品制备、生化反应及结果检测等过程。微流控芯片技术作为基因、蛋白质、临床诊断、环境监测和生化防卫等领域生化样品的探测、分析和操作技术越来越受人们欢迎。

伴随着生物标志物临床应用的特点(如心肌标志物浓度及其动态监测)，定量POCT产品需求迫切，然而由于目前基于侧向层析技术的定量检测POCT存在重复性差、准确性低等特点，限制了定量POCT的应用。微流控芯片突出优势有以下几点：首先，其具有可灵活组合多种操作单元、整体可控的特点，可将检测过程中的多个步骤整合在一块芯片上；其次，由于芯片内的通道结构为微米级甚至纳米级，因而具有高比表面积、高扩散系数、传热快等特性，有效地加速了通道内的反应，大大缩短了整个分析时间；此外，由于在芯片微米级通道内进行检测，样品和试剂的消耗量仅为微升级甚至纳升级，极大降低了检测成本，可同时实现快速和低成本检测。

目前，基于毛细力驱动的微流控芯片主要有微点生物mlabs平台、Alere Trage平台，这两种平台均采用m型芯片设计，样本反应通道较短，亲和反应需要在很短的时间内完成，因此对抗体的亲和力要求较高。

此外，通常芯片内流体泳动通道侧壁由基片与盖片之间的胶层或其它物理结构形成，这种通道不仅在芯片封接过程中会产生溢胶或形成不规则焊点影响流体流动，而且要求很高通道表面处理均一性才能保证通道内不产生气泡。

而本文提供了一种无壁的无壁微流体通道，由于这种结构两边气压相等，更有利于流体泳动，有效解决通道气泡问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种毛细力驱动的测试卡，该测试卡具有无壁微流体通道，由于这种结构两边气压相等，更有利于流体泳动，有效解决通道气泡问题，同时测试卡灵敏性更强。

为实现上述目的，本发明的是通过下述技术方案实现的：

一种毛细力驱动的测试卡，包括自上而下依次叠加在一起的盖片、双面胶层、基片；所述盖片上设有加样区、疏水沟槽组；所述疏水沟槽组围绕成蛇形通道，蛇形通道一端与加样区相通，另一端为封闭端；所述双面胶为中空，只有周边与盖片、基片粘合在一起。

所述疏水沟槽深度0.1-1mm，优选0.1-0.4mm。

所述基片上流体利用毛细力被疏水沟槽束缚在蛇形通道中间沿着盖片疏水沟槽围出的轨道进行涌动，形成蛇形无壁微流体通道。所述无壁微流体通道长度26-425毫米。

本发明所述盖片的加样区包括滴样孔和滤膜，滤膜密封滴样孔。所述加样区用于样本滴入和颗粒物过滤，通过滤膜滤过后使液体流入蛇形无壁微流体通道进行测定。所述滴样孔形状圆形或水滴状。

本发明所述基片正对滴样孔相应位置设有与滴样孔形状相匹配的样品槽,样品槽中设有多个支撑件，所述支撑件用于支撑盖片中的滤膜。所述支撑件为圆柱形。

本发明所述基片流体运行轨迹即蛇形无壁微流体通道上从开口方向依次设有样本缓存区、信号区、干扰物清除区、捕获反应区、控速区、废液区。

所述样本缓存区用于连接加样区和信号区。样本缓存区为样本缓存沟槽，所述缓存沟槽为梯形。

所述信号区用于连接样本缓存区和干扰物清除区，所述信号区长度2-30毫米，优选30毫米。信号区表面涂布有信号物标记的且可以与待测物亲和结合的物质。当待测物流到信号区时，表面涂布的信号物质快速溶解，并与待测物亲和结合形成待测物-信号物复合物，一起向前涌动。

所述干扰物清除区用于连接信号区和捕获反应区，所述干扰清除区表面固定有可以捕获干扰物的干扰物清除剂。当待测物溶液流经该区域时，溶液中干扰物质被固定在此区域的物质捕获而固定，无法向前泳动，干扰物质无法进入捕获反应区，进而提高检测的特异性。所述干扰物清除区长度2-30毫米,优选长度为30毫米。所述干扰清除剂的量为0.01-200ug/cm²，优选0.1-100ug/cm²。

所述捕获反应区用于连接干扰物清除区和控速区，所述捕获反应区表面设有捕获物固定区，固定有可以捕获待测物的捕获物。当待测物或待测物-信号物复合物流经此区域时，被固定有此区域的捕获物而捕获，通过信号采集设备可获得检测信号，用于待测物浓度分析。所述捕获反应区长度10-50毫米，优选长度为50毫米。所述捕获物包括但不限于特异性结合的受体或配体(如抗原、抗体、核酸适配体、分子印迹等)。所述捕获反应区表面进行粗糙化处理，不仅可以降低液体在通道的流速利于目标物捕获，而且可以增加比表面积，提高捕获物的固定量，进一步提高检测灵敏度。所述表面粗糙化处理表面粗糙度Ra为0.1um‐200um，优选范围为0.5um‐100um。

所述控速区用于连接捕获反应区和废液区：此区涂布有低亲水物质。微流体流经此区域时，由于表面亲水性降低，流体流动速度降低，利于捕获区捕获物捕获待测物，以提高检测的灵敏度。所述控速区长度2-25毫米，优选25毫米。所述低亲水物质包括但不限于酪蛋白、明胶等溶解性较低的物质，优选明胶。所述低亲水物质浓度为0.01-100ug/cm²，优选1.0ug/cm²。

所述废液区连接控速区，所述废液区涂布高亲水性物质。所述废液区不仅存储反应废液，而且当流体流经此区时，流体流动速度增加，以缩短反应时间。所述废液区长度10-80毫米，优选80毫米。所述高亲水性物质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、超亲水纳米颗粒、多聚赖氨酸等溶解性高的物质，高亲水性物质浓度为0.01-100ug/cm²。优选高亲水性物质为锐钛和/或BSA，进一步优选0.001-0.1％锐钛和3％BSA联用。

本发明测试卡还包括压力平衡孔，用于测试卡内部压力平衡。所述压力平衡孔分别设置在盖片和基片上。优选盖片的压力平衡孔设置在样品缓存区相应盖片位置上，所述压力平衡孔为圆形，直径为0.3毫米。所述基片设有压力平衡孔与外界相通，优选椭圆形。

本发明所述的盖片为透明板，优选透明亚克力板；所述基片为不透明板，优选白色亚克力板。

本发明的测定卡工作原理：含有待测物质的血液通过加样孔滴在滤膜区的滤膜上，血细胞被滤膜截留，血浆然后向下渗入基片的样本槽，然后流入缓冲槽，最后利用毛细力沿着盖片围出的轨道进行涌动。

本发明的测试卡可用于测试血液、体液等液体样本的测试。

本发明的另一技术方案是提供一种肺炎支原体测试卡，是由上述测试卡制备而成，其中

a.加样区：选用滤膜材质选用whatman903或Fusion5；

b.信号区表面涂布量子点信号区：表面涂布量子点标记羊抗人IgM抗体(QD-Ab_{GaHu IgM})，可与样本中人IgM结合，形成QD-Ab_{GaHu IgM}-IgM复合物；

c.干扰物清除区：表面固定有0.01-200ug/cm²羊抗人IgG抗体(Ab_{GaHu IgG})，可以捕获样本中人IgG；优选100ug/cm²羊抗人IgG抗体(Ab_{GaHu IgG})；

d.捕获反应区：表面固定有0.5ug(5.6ug/cm²)MP重组蛋白，可以捕获样本中特异的QD-Ab_{GaHu IgM}-IgM复合物；

e.控速区：此区涂布有0.01-100ug/cm²明胶(sigma)，可以有效降低流速，提高检测灵敏度，优选100ug/cm²明胶；

f.废液区：此区涂布有含有0.001-0.1％锐钛(40nm，阿拉丁试剂)0.1-3％BSA(牛血清白蛋白)(amresco)(3.5ul/cm²)溶液，可以提高流体的流动速度，缩短总体反应时间，优选0.01％锐钛。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明测试卡采用疏水沟槽结构设计，流体利用毛细力被束缚在两个疏水沟槽之间沿着疏水沟槽围成的轨迹涌动，基板上微流体通道左右无壁；盖片基片通过中空的双面胶层连接，其盖片基片之间距离为双面胶层厚度因此盖片基片表面没有接触，流体与盖片或胶层都有接触；因此本发明的微流体通道是无壁的，两边气压相等，更有利于流体泳动，有效解决通道气泡问题。

2、此蛇形测试卡通过延长捕获反应区和信号区之间的距离，即增加干扰物清除区，不仅可以延长待测物与信号物质的反应时间，提高检测灵敏度，而且干扰物清除区特殊表面处理即涂布有干扰物清除剂，可以有效清除干扰物，提高检测的特异性。

3、控速区特殊的表面处理即涂布有低亲水性物质，可以有效降低微流体的流动速度，增加待测物在捕获反应区的滞留时间，进一步提高检测的灵敏度。

4、通过不同区域的亲水性/疏水性处理，可以更合理的分配各个区域的反应时间，在保证不延长总体反应时间的同时，可以有效提高检测的灵敏度。

5、在捕获反应区微通道通道的表面粗糙化处理，不仅可以降低液体在通道的流速利于目标物捕获，而且可以增加比表面积，提高捕获物的固定量，进一步提高检测灵敏度。

附图说明

图1是根据本发明的测定卡结构示意图。

图2是根据本发明的测定卡盖片平面结构示意图。

图3是根据本发明的测定卡基片平面结构示意图。

图4是根据本发明的双面胶层结构示意图。

图5是根据本发明的测试卡盖片截面结构示意图。

图6是根据本发明的测试卡基片加样区、样本缓存区、信号区截面结构示意图。

图7是根据本发明的测试卡基片干扰物清除区、捕获反应区、控速区截面结构示意图。

图8是根据本发明的测试卡基片废液区截面结构示意图。

主要附图标记说明：

1-盖片，11-加样区，111-滴样孔，112-滤膜，12-盖片压力平衡孔，13-疏水沟槽，14-蛇形通道，15-周边粘贴面，2-双面胶层，3-基片，31-滴样槽，311-支撑架，32-蛇形无壁微流体通道，321-样本缓存沟槽，322-信号区，323-干扰物清除区，324-捕获反应区，325-捕获物固定区；326-表面粗糙化处理，327-控速区，328-废液区，33-基片压力平衡孔。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1

如图1-图4所示，根据本发明具体实施方式的一种毛细力驱动的测试卡，包括自上而下依次叠加在一起的盖片1、双面胶层2、基片3；所述盖片1上设有加样区11、疏水沟槽组13；疏水沟槽组13围绕成蛇形通道14，蛇形通道14一端与加样区11相通，另一端为封闭端；所述双面胶2为中空，只有周边15与盖片1、基片3粘合在一起。

所述基片3上流体利用毛细力被疏水沟槽组13束缚在蛇形通道14中间沿着盖片疏水沟槽13围出的轨道进行涌动，形成蛇形无壁微流体通道32。

如图5所示，本发明所述盖片1的加样区11包括滴样孔111和滤膜112，滤膜112密封滴样孔111。

如图3,6,7，8所示，本发明所述基片3正对滴样孔111相应位置设有与滴样孔111形状相匹配的滴样槽31,滴样槽31中设有多个支撑件311，所述支撑件311用于支撑盖片1中的滤膜112。所述支撑件311为圆柱形，高度为0.35毫米。

所述蛇形无壁微流体微通道32从开口方向依次设有样本缓存区321、信号区322、干扰物清除区323、捕获反应区324、控速区327、废液区328。

所述样本缓存区321用于连接加样区滴样槽31和信号区322。样本缓存区为样本缓存沟槽，所述缓存沟槽为梯形，长度6.5毫米。

所述信号区322用于连接样本缓存区321和干扰物清除区323，所述信号区长度30毫米。信号区表面涂布有信号物标记的且可以与待测物亲和结合的物质。当待测物流到信号区时，表面涂布的信号物质快速溶解，并与待测物亲和结合形成待测物-信号物复合物，一起向前涌动。

所述干扰物清除区323用于连接信号区322和捕获反应区324，所述干扰物清除区长度30毫米。所述干扰清除区表面固定有可以捕获干扰物的干扰物清除剂。当待测物溶液流经该区域时，溶液中干扰物质被固定在此区域的物质捕获而固定，无法向前泳动，干扰物质无法进入捕获反应区，进而提高检测的特异性。

所述捕获反应区324用于连接干扰物清除区323和控速区327，所述捕获反应区324表面进行粗糙化处理326并设有捕获物固定区325，固定区固定有可以捕获待测物的物质。所述捕获反应区长度50毫米。当待测物或待测物-信号物复合物流经此区域时，被固定有此区域的捕获物而捕获，通过信号采集设备可获得检测信号，用于待测物浓度分析。

所述控速区327用于连接捕获反应区325和废液区328，所述控速区327表面涂布有低亲水性物质。微流体流经此区域时，由于表面亲水性降低，流体流动速度降低，利于捕获区捕获物捕获待测物，以提高检测的灵敏度。所述废液区长度25毫米。

所述废液区328连接控速区327，所述废液区涂布高亲水性物质,废液区长度80毫米。所述废液区不仅存储反应废液，而且当流体流经此区时，流体流动速度增加，以缩短反应时间。

本发明测试卡还包括压力平衡孔(12,33)，用于测试卡内部压力平衡。所述压力平衡孔分别设置在盖片1和基片3上。优选盖片的压力平衡孔12设置在样品缓存区相应盖片位置上，所述压力平衡孔为圆形，直径0.3毫米。所述基片设有压力平衡孔33与外界相通，优选椭圆形。

本发明的测定卡盖片为1mm厚透明亚克力板，中间层为厚度100μm双面胶(3M公司)，下层为2mm厚白色亚克力板。基片、盖片、中间粘贴层采用激光雕刻机进行制备。

实施例2一种肺炎支原体测定卡

在肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)特异性IgM测定过程中，MP特异性IgG会竞争结合MP抗原，干扰特异性IgM测定，因此在检测中需将IgG清除。取实施例1测试卡制备各个功能区处理方式如下：

a.其中信号区表面涂布量子点标记羊抗人IgM抗体(QD-Ab_{GaHu IgM})，可与样本中人IgM结合，形成QD-Ab_{GaHu IgM}-IgM复合物；

b.干扰物清除区：表面固定有100ug/cm²羊抗人IgG抗体(Ab_{GaHu IgG})，可以捕获样本中人IgG。

c.捕获反应区：表面固定有0.5ug(5.6ug/cm²)MP重组蛋白，可以捕获样本中特异的QD-Ab_{GaHu IgM}-IgM复合物。

d.控速区：此区涂布有100ug/cm²明胶(sigma)，可以有效降低流速，提高检测灵敏度。

e.废液区：此区涂布有含有0.01％锐钛(40nm，阿拉丁试剂)3％BSA(amresco)溶液(3.5ul/cm²)，可以提高流体的流动速度，缩短总体反应时间。

实施例3各反应区的处理物筛选过程

采用试验1的方法制备的测试卡，通过对比各个功能区不同的处理方式对P/N值(阳性样本相对荧光强度/阴性样本荧光强度)(和迈荧光读数仪)和反应时间的影响，P/N越大，测试卡灵敏度越高。

表1

通过上表1可见，加样区滤膜的型号对结果影响不大，干扰物清除区中Ab_{GaHu IgG}浓度0.01-200ug/cm²效果较好，产业化角度优选100ug/cm²。捕获反应区表面粗糙度Ra0.1-200um效果较好，产业化角度优选0.5-100um,控速区明胶浓度0.01-100ug/cm²效果较好，产业化角度优选1.0ug/cm²。废液区锐钛和BSA联合对存储废液效果及缩短总反应时间具有协同作用，优选0.001-0.1％锐钛和3％BSA联用。疏水沟槽深度优选0.1-0.4mm。

实施例4

采用试验1的方法制备的测试卡，通过对比各个功能区长度对P/N值(阳性样本相对荧光强度/阴性样本荧光强度)(和迈荧光读数仪)的影响，P/N越大，测试卡灵敏度越高。

表2

通过表2可见，各区的长度越长越好，但是由于延长通道会增加反应的时间，因此在实际应用中为了较快的获得测试结果(如急诊项目)，故选用上述结果。

实施例5本发明的测定卡与现有技术测定卡在特异性和灵敏度的对比数据

采用试验2制备的测试卡和肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)(同昕生物技术(北京)有限公司)测定肺炎支原体IgM阳性样本100例，阴性样本100例，比较测试卡和肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)的特异性和灵敏度，结果如表3，

表3

结果表明，测试卡具有较高的灵敏度和特异性。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。