一种含有氯霉素的鱼肉粉标准物质制备方法与流程

本发明涉及一种含有痕量氯霉素的鱼肉粉基体标准物质制备方法，鱼肉粉中氯霉素标准物质是一种计量标准，主要用于校准计量器具和评价测量方法的准确度。
背景技术：
：氯霉素(chloramphenicol，CAP)，学名D-苏式-(-)-N-[α-(羟基甲基)-β-羟基-对硝基苯乙基]-2,2-二氯乙酰胺，分子式为C11H12Cl2N2O5，白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，熔点149-153℃，比旋光度19.5℃，水溶性为2.5g/L。易溶于水和甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇等。CAS号为56-75-7，分子量323.1294。化学结构式如图1所示。氯霉素是一种高效广谱抗生素，在动物传染性疾病防治方面得到了广泛应用。但是食用动物中残留的氯霉素可通过食物链在人体中富集，对健康构成潜在危害。欧盟、美国已将氯霉素列为法定禁用兽药，欧盟确定最低限量为0.3μg/kg，我国也规定动物性食品中氯霉素“不得检出”。气相色谱-质谱法或液相色谱-质谱法(LC-MS)是目前氯霉素检测的最主要确证方法。但由于质谱检测的特点要求样品的前处理及净化过程复杂，主要包括氯霉素提取、蛋白质去除、杂质净化、浓缩、过滤等过程使得分析成本高、通量低，更为重要的是，繁琐复杂的前处理过程、条件控制、基体效应等影响了检测结果的可靠性与准确度，文献报道的液相色谱-质谱联用或者气相色谱-质谱联用方法的结果相对标准偏差(RSD)一般在20％～35％之间，直接影响了在限量值附近结果的判定。为保证水产品中痕量氯霉素残留检测结果具有溯源性、可比性和准确性，亟需开展具有准确赋值，均匀、稳定的鱼肉中氯霉素标准物质的研制。该标准物质的成功研制能够保证鱼肉中氯霉素测量结果的准确可靠，进而对保障食品安全有着极其重大的社会效益和经济效益。技术实现要素：本发明提供一种含有氯霉素的鱼肉粉标准物质制备方法。本发明的目的是提供一种含有痕量氯霉素的鱼肉粉标准物质，具有良好的均匀性和稳定性。该标准物质的使用有利于提高鱼肉中氯霉素痕量残留检测中标准物质与样品的基体匹配程度，从而提高检测结果的准确性和可靠性。本发明还提供一种含有氯霉素的鱼肉粉基体标准物质的制备方法，包括：样品预处理：将鱼肉剔除鱼刺与鱼皮、筋膜，切块，绞碎，作为原料；取原料适量，按照1:3的比例，加水稀释成肉浆，采用5000rpm，低温高速均质3min，重复匀浆10次，每次间隔30min；匀浆液装入冷冻盘；所述冷冻盘中样品厚度不能超过2cm。预冻样品：所述样品共晶点为-15℃，设置预冻温度设为-20℃；预冻速率为10℃/min；快速预冻2小时；第一阶段升华干燥：将所述冷冻盘装入干箱，当干箱压力较常时间保持不变后，以5℃/次的速率逐步提高搁板温度，直至-5℃；当样品温度升至接近于搁板温度或者干箱真空度与冷阱真空度接近并保持恒定时，继续干燥1小时；第二阶段升华干燥：一次调整搁板温度至样品允许的最高温度0-4℃以下；自动调节渗气，时间为2小时之上；样品达到最高允许温度后，恢复干箱内真空度，恒温4小时；研磨制粉：将冻干样品在研磨机中研碎，研磨速率为3000rpm，研磨1min；筛分：采用35目筛，超声脉冲筛分样品；混匀：样品置于10L混匀桶中，连续混匀6小时；得到鱼肉粉基体标准物质。分装：样品包装在15mL透明样品瓶中，每瓶约2.5g；辐照：采用放射性同位素钴-60产生的γ射线，对冻干粉进行辐照杀菌，辐照剂量为4kGy。本发明与其他技术相比，其优势在于：1)将样品预处理后与水以适当比例混合后匀浆，采用冷冻干燥方法获得冻干鱼肉，经过研磨、筛分、混匀、辐照等步骤，制备获得具有良好均匀性的冻干鱼粉。2)通过模拟饲喂，获得氯霉素污染的鱼肉原料，该原料能够完全模拟实际检测中的氯霉素污染鱼肉样品；3)采用该技术制备鱼粉中氯霉素的含量水平(0.6μg/kg)与欧盟最低残留限量水平(0.3μg/kg)在一个数量级，满足痕量残留检测的需要。本发明提供的方法制备的含有氯霉素的冻干鱼粉，均匀性和稳定性良好，可用于水产品中氯霉素痕量残留检测中分析方法的评价、分析过程的质量控制及实验室能力考核。作为标准物质也可并用于校准计量器具和评价测量方法，操作简单，易于推广。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、说明书附图、权利要求书中所特别指出的结构来实现和获得。下面结合附图，通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为氯霉素分子结构图；图2为鱼粉样品的氯霉素LC-MSMS的MRM检测谱图。具体实施方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。本实施例中，首先需要获取原材料，也就是含有氯霉素的鱼肉样品。采用饲喂的方式得到标准物质候选物。购买罗非鱼，保证饲喂所用的水以及鱼缸均不含有氯霉素，空白饲养两周后，初步检测，确定鱼肉为空白样品。按照一定剂量在水体里加入氯霉素，每周更换水体后重复添加氯霉素，连续饲养6周。1、鱼肉样品预处理：(1)取阳性罗非鱼，剔除鱼刺与鱼皮、筋膜等，切块，绞碎，作为原料。(2)取原料适量，按照1:3的比例，加水稀释成肉浆，采用5000rpm，低温高速均质3min，重复匀浆10次(每次间隔30min)。(3)匀浆液装入冷冻盘(30cm*30cm*5cm)，盘中样品厚度不能超过2cm。2、鱼肉冻干粉制备：(1)预冻样品：样品共晶点为-15℃，设置预冻温度设为-20℃；预冻速率为10℃/min(每分钟降温11℃)；快速预冻2小时，使样品完全冻牢。(2)第一阶段升华干燥：预冻结束后，开始第一阶段升华。当干箱压力较常时间保持不变后，以5℃/次的速率逐步提高搁板温度，直至-5℃，防止样品出现过冷，为升华提供能量，加快升华速度。当样品温度升至接近于搁板温度或者干箱真空度与冷阱真空度接近并保持恒定时，继续干燥1小时，以彻底消除样品中的残留冰晶及样品干燥的不均衡性，第一阶段升华结束。(3)第二阶段升华干燥该阶段样品中已不存在冻结冰，一次调整搁板温度至样品允许的最高温度0-4℃以下。为避免干箱内压力过低影响传热，进行自动调节渗气，以使样品温度尽快达到最高温度，提高升华速率。时间为2小时之上。样品达到最高允许温度后，恢复干箱内真空度，恒温4小时，第二阶段升华干燥结束。(4)关机，取出冻干样品。称重，冻干粉得率为23％。3、研磨制粉：冻干样品在研磨机中研碎，研磨速率为3000rpm，研磨1-2min。4、筛分：采用35目筛，超声脉冲筛分样品。5、混匀：样品置于10L混匀桶中(不超过桶体积的1/2)，连续混匀6小时。6、分装：样品包装在15mL透明样品瓶中，每瓶约2.5g。7、辐照：采用放射性同位素钴-60产生的γ射线，对冻干粉进行辐照杀菌，辐照剂量为4kGy。对上述方法制得的痕量氯霉素的冻干鱼粉样品进行均匀性检验和稳定性监测。(一)均匀性检验均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。均匀性的检测方法：前处理：称取鱼肉2g。加入10mL0.1mol醋酸钠缓冲溶液(pH＝5)，涡旋2min，再加入20mL乙酸乙酯，涡旋1min，振荡提取15min，5000r/min冷冻离心(4℃)5min，收集15mL乙酸乙酯提取液至15mL离心管中。直接过OasisPRIMEHLB柱，收集洗脱液后，在45℃水浴下氮气吹干，残渣用1ml15％甲醇水混匀，过0.22μmGHP滤膜，供LC/MS/MS测定。仪器分析：AB-QTRAP5500；色谱柱：ACQUITYCSHTMC18，1.7μm，3.0×100mm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A相：水+0.1％乙酸；B相：甲醇；流速为0.3ml/min。其它流动相条件见表1。表1其它流动相条件Time(Time)0.01133.0155.018PumpB157070909015Stop质谱条件：负离子扫描方式；多反映监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：-4500V；气帘气压力(CUR)：15psi；雾化气压力(GS1)：55psi；辅助气压力(GS2)：50psi；离子源温度：550℃；定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)以及碰撞气能量(CE)的条件见表2。表2氯霉素定量定性离子对及质谱相关工作参数从标准物质的300个包装中随机抽取15个包装，每个包装取3个子样进行瓶间和瓶内均匀性检验。最小取样量为0.5g，按照如下所述的液相色谱同位素稀释质谱法(LC-IDMS/MS)进行测试。将均匀性方差分析结果sbb与所用方法的重复性sr或该特性量值不确定度的预期目标进行比较，若不显著，则标准物质视为均匀。应计算待测特性量值的不均匀性引入的不确定度分量ubb，并将其计入标准物质总的不确定度中。按照上述方法对标准物质进行了均匀性检验，均匀性检验结果见表3。表3均匀性检验结果瓶间标准偏差的估计值用下式计算：重复性标准偏差sr可以用s22计算：结果发现sbb>sr，故瓶间均匀性标准偏差sbb＝ubb＝0.0164μg/kg。本标准物质均匀性引入的不确定度为0.0164μg/kg(二)稳定性检测稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性量值随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。对于本标准物质，采取同步稳定性评估的方法，按先密后疏的原则，考察在规定保存条件(0-4℃)下，保存0、1、2、3、6个月后样品的稳定性。按照如前所述的液质联用方法进行测试，每次取5个包装，每个包装取一个子样，测3次，计算平均值，把5个包装的测量结果平均值作为检测结果。采用趋势分析法对标准物质的稳定性监测数据进行计算，并评价稳定性引入的不确定度，以结果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。由于没有物理或化学模型能够真实地描述鱼粉中氯霉素的降解机理，故可选用线性模型作为该候选标准物质的经验模型。稳定性性评价结果见表4，由表可知稳定性引入的不确定为0.0114ug/kg。表4鱼粉中氯霉素的长期稳定性及趋势分析(t＝6个月)(三)定值鱼粉中氯霉素基体标准物质，采用液相色谱同位素稀释串联质谱法定值，系统研究了方法、样品前处理、检测条件等，并采用多家实验室合作定值。对于制备的鱼粉中氯霉素标准物质，采用液相色谱同位素稀释质谱法多家实验室合作定值。参照ISO导则34：2000《标准物质生产者能力的通用要求》对合作者的管理能力、技术能力及硬件设施等方面对参加合作定值的实验室提出明确要求。选择8家符合要求的合作实验室。合作定值要求每个实验室对每一种标准物质测试8组数据，对于所有测试数据分别进行等精度测量判别和界外值剔除。经夏皮罗-威尔克法检验测定数据符合正态分布。定值结果如表5所示。表5定值结果定值结果：鱼粉中氯霉素标准物质的标准值为0.601μg/kg，不确定度为0.043μg/kg。如图2所示，为鱼粉样品的氯霉素LC-MS/MS的MRM检测谱图。综上所述，本方法制备的含有氯霉素的冻干鱼粉，均匀性和稳定性良好，可用于水产品中氯霉素痕量残留检测中分析方法的评价、分析过程的质量控制及实验室能力考核。作为标准物质也可并用于校准计量器具和评价测量方法，操作简单，易于推广。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页1 2 3