一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片的制作方法

本发明涉及一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片，该纸微流控芯片检测细胞内小分子H₂O₂，能够广泛应用于疾病的早期诊治、药物筛选等领域。

背景技术：

21世纪是科学技术突飞猛进的时代，传统的分析技术也在经历着深刻的改革。其中，分析设备正走向微型化、集成化以及便携化。微流控芯片实验室，又称μTAS（微型全分析系统），是一种以在微米尺度的空间中对流体进行操控为主要特征的技术,具有将生物和化学实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米大小的芯片上的能力.微流控芯片实验室的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小可控平台上的灵活组合和规模集成。微型全分析系统是在上世纪九十年代由Manz等首次提出。经过几十年科研工作者的不断探索，微流控芯片已经成为一个独立的科学领域，并在实际生活中得以应用，逐渐在分析化学和生物医学领域发挥着愈来愈重要的作用。

纸微流控芯片或微流控纸分析简称纸芯片，是微流控技术发展的最新领域，在2007年，被Whitesides研究组首次提出。纸芯片是以纸代替传统的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在纸的表面加工出具有一定结构的微流体通道的微型分析器件，常用的加工方法有石蜡打印法、喷墨打印法、丝网印刷法、光刻法等，一般用蜡、AKD、SU-8 光胶等作为纸芯片疏水隔离带的疏水材料。纸芯片结合了微流控技术和纸的优点。与传统的微流控芯片相比具有以下优点：（1）试样消耗量低，成本低；（2）来源丰富，容易得到，可进行批量生产；（3）不需要外接泵，纸的主要成分是纤维素，流体在纸上通过毛细作用流动；（4） 可在纸上根据自己的意愿设计结构；（5）生物兼容性好，可通过化学修饰改变纸的性质；（6）具有生物降解性；（7）一次性便携式分析，操作简便，甚至不需要复杂的程序。基于以上优点，纸芯片在微流控技术上受到广大国内外研究者的青睐。

过氧化氢（H₂O₂）是细胞氧化还原反应的副产物，也是最稳定的活性氧（ROS），在生命体内影响着细胞的生命活动，当H₂O₂的含量较高，会导致各种生理疾病，引起各种炎症，器官损坏乃至癌症，因此对细胞H₂O₂含量的实时监测对临床诊断有着重要的意义。近年来，纳米技术已广泛用于化学、生物、医学、材料、电子等学科领域，由于纳米材料的尺寸、形状以及表面电荷等性能与天然酶有一定的相似性。因而，利用纳米材料独特性能，合成在化学结构、催化效率、特异性和选择性上都和天然酶功能相似的纳米人工模拟酶，可以有效克服天然酶的局限性，应用于催化显色底物与过氧化氢（H₂O₂）的显色反应。模拟酶的合成方法很多， 利用水热合成法合成的新型过氧化物模拟酶、高效、绿色环保，对检测小分子H₂O₂的含量，用于疾病的诊断分析有重要的意义。因此，选择纳米无机氧化钼模拟酶（MoO₃）作为材料。对于H₂O₂ 的检测方法有很多如比色法、荧光法、电化学法、光谱法。比色法检测H₂O₂，不仅成本低、操作简单而且能实时监测细胞内H₂O₂水平。

本发明基于纸芯片易加工、低成本、微型化、便携化的独特优势，将纸微流控芯技术与纳米生物技术结合建立快速简便、经济准确的细胞内小分子H₂O₂的检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的微流控芯片。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片以滤纸为基底，通过氧化钼量子点模拟酶比色法来检测细胞内H₂O₂。

所述的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的微流控芯片，其特征在于，所采用的氧化钼量子点模拟酶MoO₃，是用水热合成法合成的。

所述的一种基于纸芯片的氧化钼量子点模拟酶比色法，其特征在于，显色体系为MoO₃、ABTS和H₂O₂。

所述的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的微流控芯片，其特征在于，H₂O₂浓度在1 μmol/L~10mmol/L 范围内，显色体系的显色强度ΔG与logH₂O₂ 浓度的对数呈良好的线性关系，其中r=0.9909，线性方程为ΔG=14.6954logC_H2O2 + 74.1004，检测限为0.52 μmol/L。

本发明所述的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的微流控芯片的测定细胞内H₂O₂的方法，包括如下步骤:

(1)MoO₃量子点的合成;（2）纸微流控芯片的 H₂O₂测定：将MoO₃ -ABTS-H₂O₂ 显色体系集成在纸微流控芯片上反应，用拍照采集颜色变化图像，ImageJ软件对颜色变化的灰度值数据处理，检测细胞内小分子H₂O₂。

具体地说，本发明所述的纸微流控芯片，以滤纸为基底，通过在纸上利用氧化钼量子点模拟酶比色法检测细胞内H₂O₂。

本发明所述的模拟酶MoO₃，是用水热合成法合成的新型的量子点。

本发明所述的检测原理为将MoO₃-ABTS-H₂O₂ 显色体系集成在纸微流控芯片上反应，通过颜色变化来检测H₂O₂。

本发明的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片测定细胞内H₂O₂的方法，依序包括如下步骤 ：

(1)MoO₃量子点的合成

将MoS₂通过超声，抽滤和水热反应后得到的滤液，即得氧化钼量子点（MoO₃）溶液。

（2）纸微流控芯片的 H₂O₂测定

将MoO₃-ABTS-H₂O₂ 显色体系集成在纸微流控芯片上反应，用拍照采集颜色变化图像，ImageJ软件对颜色变化的灰度值数据处理，检测细胞内释放小分子H₂O₂。

本发明优点:

纸微流控芯片具有易加工、低成本、微型化、便携化的独特优势。

新型过氧化物模拟酶纳米氧化钼（MoO₃）稳定、高效、绿色环保。

附图说明

图1为本发明的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片工作原理图。

图2为本发明一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片的MoO₃ 材料TEM图。

图3为本发明一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片的线性关系图。

图4为本发明一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片的细胞内过氧化氢的检测图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。

如图1所示， 本发明所述的一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片原理：基于纸芯片（优选滤纸）易加工、低成本、微型化、便携化的独特优势和新型过氧化物模拟酶纳米氧化钼（MoO₃）稳定、高效、绿色环保的特性，本发明将纸基微流控芯技术与纳米生物技术结合，把MoO₃-ABTS-H₂O₂ 显色体系集成在纸微流控芯片上反应，用拍照采集颜色变化图像，ImageJ软件对颜色变化的灰度值数据处理，检测小分子H₂O₂。ABTS指2 ,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐。

实施例1：

纳米氧化钼量子点模拟酶制备步骤如下 ：称取MoS₂纳米片0.06g，加入到去离子水400 mL中，在65℃下持续超声17小时后，用0.22 µm的微孔滤膜抽滤，收集滤饼；然后再分散到60 mL去离子水中，转入到反应釜中，在200 ℃水热反应12小时后，自然冷却后，真空抽滤，收集反应滤液，即得氧化钼量子点（MoO₃）溶液。

如图2中的A所示，该产物在水溶液中分散良好，没有出现团聚现象，粒子形状接近球形，粒径比较均一，具有较窄的粒径柱状分布图，平均粒径为3.42nm。由图2中的B中可知，该MoO₃材料的晶格间距为0.185nm，与标准的JCPDS图对应的（500）晶面的晶格间距0.1824nm很接近。

实施例2：

一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片的检测步骤如下：

在纸微流控芯片上依次滴加6μL 磷酸盐缓冲液(20 mmol/L，pH 6.0) 中依次加入2μL MoO₃、1μLABTS（10^-3 mol/L）和1μL一系列H₂O₂标准液，及抗坏血酸刺激PC12细胞后样品，浓度为10^-6 、5×10^-6 、10^-5、5×10^-4、10^-4、5×10^-3、10^-3、5×10^-2、10^-2mol/L，在暗箱里控制相同的光照条件和温度，反应10min中后用单反相机拍照成像，将得到的图像用ImageJ软件读取显色区域的灰度值，根据实验组与对照组的灰度值差，得到显色平均强度，从而根据强度进行细胞内H₂O₂定量分析。

如图3所示，显色强度与H₂O₂ 浓度对数响应曲线（ΔG= |G- G₀| ，G 为在显色体系中含有不同浓度H₂O₂ 的灰度值，G₀ 为显色体系中不加H₂O₂时的灰度值），H₂O₂浓度在1 μmol/L~10mmol/L 范围内，显色体系的显色强度ΔG与logH₂O₂ 浓度的对数呈良好的线性关系（r=0.9909），线性方程为ΔG=14.6954logC_H2O2 + 74.1004，检测限为0.52 μmol/L。

实施例3：

一种用于纳米氧化钼模拟酶检测细胞内过氧化氢的纸微流控芯片的检测步骤如下：

当PC12细胞在培养瓶底铺满后，倾倒出培养基。加入磷酸盐缓冲液，吹打悬浮，计数细胞悬液5 mL（～5×10⁷cells/mL），，并加入5 μL 10^-3 mol/L 抗坏血酸，混合均匀，5 min后离心，收集离心上清液，加入到制备好的纸微流控芯片中，检测细胞内的H₂O₂，如图4所示。