本发明属于环境样品检测领域，具体涉及一种土壤和植物中1-羟基苯并三唑的检测方法。
背景技术：
苯并三唑类化合物(Benzotriazoles，BTs)是一类具有苯并三唑杂环结构的化合物，具有优异的稳定性和防腐蚀能力，与金属接触后，可在金属表面络合，形成一层保护层，从而阻止金属的腐蚀。苯并三唑类化合物作为一种大量使用的添加剂，被广泛的添加于冷冻液、液压液、防冻剂、洗涤剂以及飞机除冰/防冰液等工业制品中。1-羟基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole，HOBT)是其中一种常见的苯并三唑类化合物，基本信息如表1所示。
表1 HOBT的基本信息
近年来的研究发现，河流、湖泊、海洋和沉积物等环境介质中检测了多种苯并三唑类化合物，说明随着苯并三唑类化合物的大量使用，苯并三唑类化合物已在环境大量残留，并作为一种新兴污染物引起人们的重视。苯并三唑类化合物进入环境的途径主要有两种，一是随着产品的使用和抛弃，直接进入环境中；二是通过城市污水管网进入污水处理厂后，随着污水和污泥的排放进入环境中。大量研究表明，苯并三唑类化合物在传统活性污泥法的污水处理厂中，去除率不高，出水和污泥中都含有较高浓度的苯并三唑类化合物。近年来，污水灌溉和污泥农用等活动越来越多，苯并三唑类化合物可能会进入农田土壤中，并被农作物吸附和吸收，在食物链积累和富集，最终影响人类的健康与生存。
目前针对苯并三唑类化合物的检测主要集中在河流、湖泊和沉积物等环境水系统中，但是对于它们在是土壤和植物中的分析方法关注较少。另外，苯并三唑类化合物的研究主要在于苯并三唑、5-甲基-1H-苯并三唑和5,6-二甲基-1H-苯并三唑这三种化合物，对于1-羟基苯并三唑的研究较少。因此，为了了解土壤和植物中1-羟基苯并三唑的浓度水平和积累情况，需要建立一种高效灵敏的分析方法，用于土壤和植物中痕量1-羟基苯并三唑的检测。
技术实现要素：
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种1-羟基苯并三唑的提取、净化和仪器分析方法，用于土壤和植物中1-羟基苯并三唑的定性和定量检测。
加速溶剂萃取是近年使用较多的一种提取方法，可用于土壤、沉积物、污泥或生物样品的提取。相比超声提取、索氏抽提等提取方法，加速溶剂萃取法的操作更为简单，自动化程度高，一般提取时间只需30分钟，适合于大批量处理样品；提取过程的溶剂使用量也大大减少，对环境更友好，是一种高效的提取方法。本发明在萃取池中加入基质吸附剂，在提取过程中同步净化，对于大多数的土壤样品和色素含量低的植物样品都能有较好的净化效果，节省实验时间，提高方法灵敏度。对于秸秆、谷物等色素和脂肪含量较高的样品，可在提取之后进行固相萃取处理，进一步净化，降低基质效应。
高效液相色谱-质谱联用仪采用多反应监测模式(MRM)，对目标化合物有较高的选择性和灵敏度，有效地降低了基质干扰，适合复杂环境介质中痕量目标化合物的检测。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种土壤和植物中1-羟基苯并三唑的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
将采集的土壤样品或植物样品进行前处理；
(2)加速溶剂萃取
将步骤(1)前处理后的样品采用加速溶剂萃取仪提取，得到待测样品溶液；
(3)标准工作溶液的配制
用分析天平称取1-羟基苯并三唑和1种内标物的标准物质，分别配制成储备溶液和工作溶液，最后配制成梯度浓度的标准工作溶液；
(4)高效液相色谱-质谱联用仪检测
在高效液相色谱-质谱联用仪中测定步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液，使用内标法建立标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中的待测样品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪进行测定，通过标准工作曲线计算溶液中1-羟基苯并三唑的浓度，然后根据样品质量计算得到样品中1-羟基苯并三唑的含量；样品溶液中1-羟基苯并三唑的浓度应在标准工作曲线的线性范围内，若测得浓度超出标准工作曲线线性范围，可减少样品量再重新萃取和检测。
步骤(1)中，土壤样品前处理过程为：土壤样品采集后，去除石块等较大的杂质，干燥后磨碎并过筛后待用；植物样品前处理过程为：植物样品采集后，去除泥沙，干燥后，采用植物粉碎机粉碎均匀待用。
步骤(1)中，所述干燥可选用自然风干或冷冻干燥法，若选用冷冻干燥，样品需在冰柜内预冷冻24小时，再放入冷冻干燥仪内进行干燥。土壤样品干燥后磨碎过0.90mm筛子；植物样品干燥后使用植物粉碎机进行粉碎。样品磨碎或粉碎后，应尽快进行提取，如批量较大，未能及时提取，应将样品密封保存于4℃的冰箱或冷库中保存。
步骤(2)中，当样品为土壤样品或色素含量低的植物样品(如部分植物根部等地下部分、果肉、玉米芯等部分色素含量低的样品)时提取过程为：在不锈钢萃取池底部平铺一张滤纸，加入一定量基质吸附剂，轻敲萃取池使基质吸附剂表面平整，然后加入前处理后的样品，平整后滴加内标溶液，待内标溶液溶剂挥发后，加入石英砂，最后用放入另一张滤纸压紧，拧紧萃取池，放入加速溶剂萃取仪内进行萃取；萃取完成后，萃取液通过旋转蒸发至近干后，用1mL甲醇定容；用有机相尼龙滤膜，转移至进样小瓶，待测；
当样品为植物秸秆和谷物等色素或脂肪含量较高(大部分植物茎叶等地上部分色素含量高的样品，小麦粒、玉米粒等谷物脂肪含量高的样品)的样品时，萃取液颜色较深，直接上机检测基质干扰严重，峰型较差，可以净化后再上机检测，提取和净化过程为：在不锈钢萃取池底部平铺一张滤纸，加入一定量基质吸附剂，轻敲萃取池使基质吸附剂表面平整，然后加入前处理后的样品，平整后滴加内标溶液，待内标溶液溶剂挥发后，加入石英砂，最后用放入另一张滤纸压紧，拧紧萃取池，放入加速溶剂萃取仪内进行萃取；萃取完成后，萃取液通过旋转蒸发至近干后，用1mL甲醇定容；取Florisil固相萃取柱(1000mg，6mL)，依次用10mL二氯甲烷和10mL甲醇预淋洗Florisil固相萃取柱，以活化小柱并去除部分杂质，当柱内溶剂液面下降到接近填料表面时，立即加入待净化样品，用梨形烧瓶接收淋出液，用5mL甲醇涮洗样品瓶，将涮洗溶液加入Florisil固相萃取柱内，并重复两次；梨形烧瓶接收所有淋出液，旋转蒸发至近干，用1mL甲醇定容，用有机相尼龙滤膜过滤，转移至进样小瓶，待测。
步骤(2)中，内标溶液优选为氘代噻苯哒唑(thiabendozole NH D6)。
步骤(2)中，所述的基质吸附剂为硅胶和无水硫酸钠，其作用是提取过程中同步净化，节省实验时间。其中，硅胶为80～100目，依次用甲醇和二氯甲烷洗涤2次，晾干后，于120℃的烘箱中烘烤4小时，待用。加入基质吸附剂的具体操作为，先加入1～3g硅胶，平整表面后，加入1～3g无水硫酸钠，根据样品量适当增减基质吸附剂的使用量。
步骤(2)中，优选样品量为2～8g。若样品基质干扰较大，或者目标化合物的浓度较高，可减少样品量，并将样品与1～4倍质量的石英砂混合均匀，再加入萃取池中。植物秸秆等蓬松的样品加入萃取池后，可以轻压样品，减少体积。
步骤(2)中，所述的石英砂作为填充剂加入，加入量2～5g，视样品量而定，一方面的作用是填充萃取池的空间，在萃取充分的前提下，减少提取溶剂的使用量；另一方面是保护萃取池中的样品，防止基质吸附剂和样品在提取过程中被高压注入的溶剂冲散。
步骤(2)中，优选的萃取条件如下：萃取池容量为34mL，提取溶剂为甲醇和二氯甲烷的混合溶剂，其中甲醇比例为80％～100％(体积比)，为提高回收率，可在提取溶剂中加入提取溶剂总体积0.005％～0.01％的甲酸；提取温度为80～120℃；静态提取时间为4～6min，氮气吹扫时间为30～60s；静态循环次数为2～3次。
步骤(3)中，优选的内标物为氘代噻苯哒唑(thiabendozole NH D6)，标准工作曲线包括5～7个梯度浓度。
步骤(4)中液相色谱条件为：色谱柱：Agilent SB-C18，柱长100mm，内径3.0mm，填料粒径1.8μm；流动相A：0.01％(体积)甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～4min 40％～90％流动相B，5～10min 90％流动相B；流速：0.30mL/min；柱温40℃；进样量5～10μL。
步骤(4)中质谱条件：离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正模式检测；干燥气温度300℃，流速3mL/min；鞘气温度250℃，流速11mL/min；喷雾气压力为45psi；扫描模式：多反应监测模式(MRM)。在上述条件下，1-羟基苯并三唑和内标的质谱参数如表2所示。
表2 HOBT和内标在LC-MS/MS中的质谱参数
a粗体为定量离子
本发明利用加速溶剂萃取技术，建立了快速高效的提取方法,经过同步净化和固相萃取净化后，利用三重串联四级杆液质联用仪检测，有效地对土壤和植物中的痕量1-羟基苯并三唑进行了定量分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)提取溶剂使用甲酸酸化的混和有机溶剂，有效抑制1-羟基苯并三唑的离子化以及提取过程中的降解，显著提高了1-羟基苯并三唑的回收率。
(2)在萃取池内加入硅胶和无水硫酸钠作为基质吸附剂，提取过程中同步净化，对于土壤或沉积物等样品，有效降低了基质干扰，萃取液浓缩后可直接上机检测，减少了净化和富集的步骤，减少实验时间，加快实验效率，特别适合大批量样品的分析检测。
(3)对于秸秆、谷物等色素和脂肪含量较高的样品，在萃取后增加了固相萃取净化的步骤，使用Florisil固相萃取柱净化后，进一步降低了基质干扰，提高方法灵敏度。
(4)本发明使用内标法定量，内标物氘代噻苯哒唑与目标化合物性质相近，在仪器中的保留时间接近，在样品萃取前加入样品中，抵消了目标化合物在萃取过程中损失所造成的误差，多次实验中都得到了较好的回收率，是一种理想的内标物。
(4)目前我国研究人员对于环境中1-羟基苯并三唑的关注少，关于土壤和植物中1-羟基苯并三唑的分析检测技术更是处于技术空白，主要是由于土壤和植物样品中基质复杂导致基质干扰严重，常规检测方法的灵敏度较低，造成分析困难。本发明从前处理和仪器分析方面提供了一套高效、快速和准确的土壤和植物中1-羟基苯并三唑的提取和分析技术，填补了目前国内的技术空白。1-羟基苯并三唑的回收率为92.6％，标准偏差为2.4％，基质效应为90.7％，检出限为0.15ng/g，定量限为0.51ng/g；植物样品中，1-羟基苯并三唑的回收率为89.8％，标准偏差为1.6％，基质效应为90.3％，检出限为0.69ng/g，定量限为2.31ng/g，适用于土壤和植物介质中1-羟基苯并三唑的分析检测。
附图说明
图1为1-羟基苯并三唑(HOBT)和内标物氘代噻苯哒唑(thiabendozole NH D6)的特征离子流图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中使用的仪器与试剂
目标化合物1-羟基苯并三唑(HOBT，99％)和内标物氘代噻苯哒唑(thiabendozole NH D6，99％)，购自于Dr.Ehrenstorfer公司。实验所用甲醇和二氯甲烷均为进口色谱纯，所用水为Milli-Q水；无水硫酸钠、硅胶、石英砂为国产分析纯；实验所用玻璃器皿均用自来水洗净，Milli-Q水冲洗，烘干后，于马弗炉中300℃以上烘烤3～4小时。
提取仪器为加速溶剂提取仪ASE 300(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)配置34mL不锈钢萃取池。检测仪器为高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)Agilent1200RRLC/Agilent G6460A Triple Quadrupole。
实施例1
(1)样品前处理
土壤样品采集100g，去除石块等较大的杂质，冷冻干燥后磨碎并过0.90mm筛。
(2)加速溶剂萃取
样品采用加速溶剂萃取仪提取，提取过程：在不锈钢萃取池底部平铺一张滤纸，加入2.0g硅胶，轻敲萃取池，使硅胶表面平整，然后加入2.0g无水硫酸钠，平整表面后，加入5.0g土壤样品，平整后滴加100μL 1mg/L的内标物氘代噻苯哒唑工作溶液，待内标溶液溶剂挥发后，加入5.0g石英砂，最后用放入另一张滤纸压紧，拧紧萃取池，放入加速溶剂萃取仪内进行萃取。提取溶剂为甲醇/二氯甲烷(体积比为90：10)并加入提取溶剂总体积0.01％的甲酸，提取温度为100℃，静态提取时间为5min，氮气吹扫时间为60s，静态提取循环2次。萃取完成后，萃取液通过旋转蒸发至近干后，用1mL甲醇定容，过0.22μm有机相尼龙滤膜，并转移至进样小瓶中，待上机检测。
(3)标准工作溶液的配制
用分析天平称取1-羟基苯并三唑和内标物氘代噻苯哒唑的标准物质，分别用甲醇配制成100mg/L储备溶液并稀释成1mg/L工作溶液，最后配制成浓度为1、5、10、20、50、100和200μg/L的标准工作溶液，其中内标物浓度为100μg/L，使用内标法建立标准工作曲线。
(4)高效液相色谱-质谱联用仪检测
液相色谱条件为：色谱柱：Agilent SB-C18，柱长100mm，内径3.0mm，填料粒径1.8μm；流动相A：0.01％甲酸水溶液(体积比)；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～4min 40％～90％流动相B，5～10min 90％流动相B；流速：0.30mL/min；柱温40℃；进样量5μL。
质谱条件：离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正模式检测；干燥气温度300℃，流速3mL/min；鞘气温度250℃，流速11mL/min；喷雾气压力为45psi；扫描模式：多反应监测模式(MRM)。
在上述条件下，1-羟基苯并三唑和内标物氘代噻苯哒唑的质谱参数如表2所示。
在高效液相色谱-质谱联用仪中测定步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液注入，使用内标法建立标准工作曲线。在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪进行测定，通过标准工作曲线计算溶液中1-羟基苯并三唑的浓度，然后根据样品质量计算得到样品中1-羟基苯并三唑的含量。
定性鉴定：在相同仪器条件下，若样品中1-羟基苯并三唑的色谱峰保留时间与标准工作溶液中相应的目标化合物保留时间相一致，并且定性和定量离子对的丰度比与标准溶液一样，则可判断样品中存在1-羟基苯并三唑。
定量分析：以标准工作溶液的结果建立标准工作曲线，线性范围0～200μg/L，标准曲线相关系数>0.999，通过1-羟基苯并三唑和内标物的定量离子峰面积之比，计算1-羟基苯并三唑的浓度，最后按样品量计算样品中1-羟基苯并三唑的浓度。
加标回收率、重复性和基质效应：
回收率采用3次平行加标，加标方法为：在5.0g土壤样品中加入100μL 1mg/L 1-羟基苯并三唑标准溶液，使得样品中1-羟基苯并三唑的浓度为20ng/g，等待30min后，溶剂挥发完全，1-羟基苯并三唑吸附于样品中，按步骤(2)进行提取和检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到1-羟基苯并三唑的回收率，方法重复性以3个平行加标结果的标准偏差表示。基质效应测试方法：将空白样品提取和浓缩至1mL后，取100μL的样品溶液，在氮吹仪上吹干，加入100μL浓度为100μg/L的标准溶液，旋涡振荡，上机检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到方法的基质效应结果。方法的加标回收率、重复性和基质效应结果见表3所示，可以看出，土壤中加标浓度为20ng/g的情况下，1-羟基苯并三唑的平均回收率为92.6％，标准偏差为2.4％，基质效应为90.7％，说明方法回收率和重复性好、基质干扰低，可用于土壤样品的检测。
检出限和定量限：
样品信号强度达到3倍噪音强度时对应的浓度为检出限，样品信号强度达到10倍噪音强度时对应的浓度为定量限，具体操作为：利用数据处理软件计算出加标浓度下的信噪比，用加标浓度除以信噪比，该结果的3倍为该方法的检测限，10倍为定量限。方法的检出限和定量限结果如表3所示，可以看出，土壤中加标浓度为20ng/g的情况下，1-羟基苯并三唑的检出限为0.15ng/g，定量限为0.51ng/g，说明本检测方法灵敏度高，可用于土壤样品中痕量1-羟基苯并三唑的检测。
表3 方法回收率、基质效应、检出限和定量限
a平均值±标准偏差(％)(n＝3)；b平均值±标准偏差(％)(n＝3)；c(ng/g)；d(ng/g)
实施例2
(1)样品前处理
小麦粒样品采集50g，去除明显的杂质，冷冻干燥后使用植物粉碎机磨碎。
(2)加速溶剂萃取
样品采用加速溶剂萃取仪提取，提取过程：在不锈钢萃取池底部平铺一张滤纸，加入2.0g硅胶，轻敲萃取池，使硅胶表面平整，然后加入3.0g无水硫酸钠，平整表面后，加入5.0g小麦粒样品，平整后滴加100μL 1mg/L的内标物氘代噻苯哒唑工作溶液，待内标溶液溶剂挥发后，加入2.0g石英砂，最后用放入另一张滤纸压紧，拧紧萃取池，放入加速溶剂萃取仪内进行萃取。提取溶剂为甲醇/二氯甲烷(体积比为80：20)并加入提取溶剂总体积0.01％的甲酸，提取温度为100℃，静态提取时间为5min，氮气吹扫时间为60s，静态提取循环2次。萃取完成后，萃取液通过旋转蒸发至近干后，用1mL甲醇定容，待进一步净化。
(3)固相萃取净化
取Florisil固相萃取柱(1000mg，6mL)于固相萃取装置上，依次用10mL二氯甲烷和10mL甲醇预淋洗小柱(指Florisil固相萃取柱)，以活化小柱并去除部分杂质，当柱内溶剂液面接近填料表面时，立即加入待净化样品，用梨形烧瓶接收淋出液，用5mL甲醇涮洗样品瓶，将涮洗溶液加入小柱内，并重复两次。梨形烧瓶接收所有淋出液，旋转蒸发至近干，用1mL甲醇定容，用有机相尼龙滤膜过滤，转移至进样小瓶，待测。
(4)标准工作溶液的配制
用分析天平称取1-羟基苯并三唑和内标物氘代噻苯哒唑的标准物质，分别用甲醇配制成100mg/L储备溶液并稀释成1mg/L工作溶液，最后配制成浓度为1、5、10、20、50、100和200μg/L的标准工作溶液，其中内标物浓度为100μg/L，使用内标法建立标准工作曲线。
(5)高效液相色谱-质谱联用仪检测
液相色谱条件为：色谱柱：Agilent SB-C18，柱长100mm，内径3.0mm，填料粒径1.8μm；流动相A：0.01％甲酸水溶液(体积比)；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～4min 40％～90％流动相B，5～10min 90％流动相B；流速：0.30mL/min；柱温40℃；进样量5μL。
质谱条件：离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正模式检测；干燥气温度300℃，流速3mL/min；鞘气温度250℃，流速11mL/min；喷雾气压力为45psi；扫描模式：多反应监测模式(MRM)。
在上述条件下，1-羟基苯并三唑和内标物氘代噻苯哒唑的质谱参数如表2所示。
在高效液相色谱-质谱联用仪中测定步骤(4)中的各浓度梯度的标准工作溶液注入，使用内标法建立标准工作曲线。在相同条件下将步骤(3)中净化后的样品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪进行测定，通过标准工作曲线计算溶液中1-羟基苯并三唑的浓度，然后根据样品质量计算得到样品中1-羟基苯并三唑的含量。
定性鉴定：在相同仪器条件下，若样品中1-羟基苯并三唑的色谱峰保留时间与标准工作溶液中相应的目标化合物保留时间相一致，并且定性和定量离子对的丰度比与标准溶液一样，则可判断样品中存在1-羟基苯并三唑。
定量分析：以标准工作溶液的结果建立标准工作曲线，线性范围0～200μg/L，标准曲线相关系数>0.999，通过1-羟基苯并三唑和内标物的定量离子峰面积之比，计算1-羟基苯并三唑的浓度，最后按样品量计算样品中1-羟基苯并三唑的浓度。
加标回收率、重复性和基质效应：
回收率采用3次平行加标，加标方法为：在5.0g小麦粒样品中加入100μL1mg/L 1-羟基苯并三唑标准溶液，使得样品中1-羟基苯并三唑的浓度为20ng/g，等待30min后，溶剂挥发完全，1-羟基苯并三唑吸附于样品中，按步骤(2)进行提取和检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到1-羟基苯并三唑的回收率，方法重复性以3个平行加标结果的标准偏差表示。基质效应测试方法：将空白样品提取和浓缩至1mL后，取100μL的样品溶液，在氮吹仪上吹干，加入100μL浓度为100μg/L的标准溶液，旋涡振荡，上机检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到方法的基质效应结果。方法的加标回收率、重复性和基质效应结果见表4所示，可以看出，小麦粒中加标浓度为20ng/g的情况下，1-羟基苯并三唑的平均回收率为89.8％，标准偏差为1.6％，基质效应为90.3％，说明方法回收率和重复性好、基质干扰低，可用于植物样品的检测。
检出限和定量限：
样品信号强度达到3倍噪音强度时对应的浓度为检出限，样品信号强度达到10倍噪音强度时对应的浓度为定量限，具体操作为：利用数据处理软件计算出加标浓度下的信噪比，用加标浓度除以信噪比，该结果的3倍为该方法的检测限，10倍为定量限。方法的检出限和定量限结果如表3所示，可以看出，小麦粒中加标浓度为20ng/g的情况下，1-羟基苯并三唑的检出限为0.69ng/g，定量限为2.31ng/g，说明本检测方法灵敏度高，可用于植物样品中痕量1-羟基苯并三唑的检测。
表4 方法回收率、基质效应、检出限和定量限
a平均值±标准偏差(％)(n＝3)；b平均值±标准偏差(％)(n＝3)；c(ng/g)；d(ng/g)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。