一种磷酸特地唑胺及其有关物质的分析方法与流程

本发明属于药物分析领域，特别是涉及一种用高效液相色谱法分离测定磷酸特地唑胺及其有关物质的方法。
背景技术：
：磷酸特地唑胺(tedizolidphosphate，式(i))是由卡毕思特制药公司(cubistpharmaceuticals)研制的一种噁唑烷酮类抗生素，于2014年6月10日获得fda批准上市，商品名为sivextro，用于治疗金黄色葡萄球菌和各种链球菌属和粪肠球菌等革兰氏阳性细菌引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。磷酸特地唑胺属于噁唑烷酮类抗生素，与其他类别的抗生素之间不易产生交叉耐药，同首个噁唑烷酮类抗生素利奈唑胺相比，疗效更好、安全性更高。有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。基于安全性和生产实际情况的考虑，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大、危害人体健康、无效或影响药物稳定性的有关物质必须严格控制。因此，有关物质的检测是控制药物质量的关键指标。磷酸特地唑胺有关物质检测的难点在于合成和保存过程中产生多种杂质与主成分难于分离。目前，磷酸特地唑胺的质量标准在现行版《欧洲药典》及其药典论坛、《美国药典》及其药典论坛和中国药典2015版中均没有收载。因此，开发磷酸特地唑胺及其有关物质的有效的分析检测方法是非常必要的。技术实现要素：本发明的目的是提供一种同时测定磷酸特地唑胺及其有关物质的高效液相色谱分析方法，使溶剂峰和有关物质达到简便、有效分析的目的，并同时提高有关物质的定量分析的灵敏度。磷酸特地唑胺及其有关物质种类如下：检测仪器：高效液相色谱仪；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，优选watersxterrac18(150*4.6mm,3.5μm)或waterssunfirec18(150*4.6mm,3.5μm)；流动相：乙腈-四氢呋喃混合溶剂为有机相，铵盐水溶液或铵盐水溶液与选自液氨、氨水或三乙胺的碱的混合液为缓冲液；有机相优选体积比为9:1的乙腈-四氢呋喃混合液；缓冲液优选ph范围为ph8.3-ph8.7之间，更优选ph值为ph8.5；所述铵盐优选为碳酸氢铵、碳酸铵、醋酸铵、氯化铵；所述缓冲液更加优选为经氨水调ph至ph8.5的25mmol/l醋酸铵溶液。按下列梯度程序洗脱：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09913053474053474299152991检测器：uv检测器。本发明所述的检测方法，其流动相流速常见的范围一般为0.5ml/min-2ml/min，本发明优选0.8-1.2ml/min，更优选1.0ml/min。本发明所述的检测方法，检测波长为300nm。本发明所述的检测方法，色谱柱温度35-45℃，优选为40℃；样品进样量10-30μl，优选10μl进样。在一些实施例中，本发明有关物质选自以下杂质：bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma。本发明的方法与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下同时分离磷酸特地唑胺及其12种杂质，避免了在检测中频繁更换色谱条件，提高工作效率，适合工业大生产的要求；(2)本发明方法所用仪器设备及试剂均为常规用品，实验操作无苛刻条件，成本低廉；(3)本发明的检测方法专属性好，各杂质和磷酸特地唑胺之间均达到有效分离，各杂质与主峰之间分离度较好，各杂质之间分离度较好；精密度试验结果保留时间和峰面积的rsd值均小于2％，表明系统适用性良好；(4)拟定磷酸特地唑胺有关物质检查浓度为250μg/ml，各物质相当于主成分0.03％以上均能有效检出，相当于主成分0.05％以下均能够准确定量，表明所述色谱条件灵敏度高，适合进行杂质控制，能够满足有关物质检查的要求。附图说明附图1是混合溶液在300nm检测波长下的色谱图。附图2是按专利wo2010042887a2方法磷酸特地唑胺粗品在300nm检测波长下的色谱图。附图3是磷酸特地唑胺样品碱破坏高效液相色谱图。附图4是磷酸特地唑胺样品酸破坏高效液相色谱图。附图5是磷酸特地唑胺样品氧化破坏高效液相色谱图。附图6是磷酸特地唑胺样品高温破坏高效液相色谱图。附图7是磷酸特地唑胺样品高湿破坏高效液相色谱图。附图8是磷酸特地唑胺样品光照破坏高效液相色谱图。附图9、附图10、附图11是磷酸特地唑胺及各有关物质线性图。具体实施方式下面通过实施例来进一步解释和说明本发明。本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法基础上对本发明的简单改进或替换均属于本发明要求保护的范围。以下实施例中检测用磷酸特地唑胺及其有关物质均由实验室合成，所使用的的分析试剂及溶液均可从市场上购得获得可以通过本发明所描述的方法制备而得。本发明所使用的分析试剂及溶液符合中国药典2015版附录的要求，除另有说明外。hplc：岛津2010高效液相色谱仪或agilent1100高效液相色谱仪；色谱柱：watersxterrac18(150*4.6mm,3.5μm)或waterssunfirec18(150*4.6mm,3.5μm)。实施例一磷酸特地唑胺和几种有关物质的高效液相色谱分析几种有关物质为：bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma、tdpen仪器与分析条件——高效液相色谱仪为岛津2010或agilent1100；色谱柱为watersxterrac18(150*4.6mm,3.5μm)；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为300nm；以25mmol/l醋酸氨(用氨水调ph至8.5)为流动相a，以乙腈:四氢呋喃(90：10)为流动相b，流速为1.0ml/min；柱温为40℃；理论板数按磷酸特地唑胺峰计算不低于3000；按下表进行梯度洗脱：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09913053474053474299152991实验步骤：精密称取bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma、tdpen适量，加25mmol/l碳酸氢铵溶液溶解并稀释制成浓度为20μg/ml的溶液，作为定位溶液；取上述杂质和tdp适量，加25mmol/l碳酸氢铵溶液制成浓度为每1ml含tdp200μg、其他杂质均为1μg的溶液，作为供试品溶液。精密量取上述各溶液10μl，按上述条件进行高效液相分析，结果如表1所示，色谱图见说明书附图图1。表1磷酸特地唑胺与各杂质的分离情况结论：该色谱条件下，空白干净，且各杂质与主峰以及各杂质之间均能较好的分离，bp42峰1和峰2的分离度只有1.11，但考虑到两者互为异构体，不再对其进行完全分离，因此上述条件可用于磷酸特地唑胺的有关物质控制。对比例一分别精密量取实施例一中所述定位溶液和供试品溶液各10μl，在300nm检测波长下按专利wo2010042887a2中磷酸特地唑胺的纯度测定条件——色谱柱为waterssunfirec18(150*4.6mm,3.5μm)、流动相a为25mmol/l碳酸氢铵溶液:乙腈＝87：13、流动相b为乙腈、流速为1.0ml/min、柱温为40℃、梯度程序如下：时间(min)a％b％0.098.02.015.05.095.025.05.095.027.098.02.037.098.02.0进行进样，记录色谱图，如说明书附图图2所示。结论：该条件下，空白梯度鬼峰明显，ina08和bp42峰重合，bp22与ina重合，ddg14与tdp分离效果较差。实施例二本发明分析方法的方法学考察1、系统适用性考察溶液配制：分离度考察溶液：分别取bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma和磷酸特地唑胺对照品适量，加流动相a定量稀释制成每1ml中含其他杂质均为1.25μg和磷酸特地唑胺250μg的混合溶液，作为分离度溶液。供试品溶液：取盐酸磷酸特地唑胺对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。进样检测：精密量取稀释剂、分离度溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，考察杂质的分离情况；精密量取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，考察峰面积及保留时间的相对标准偏差，结果见表2-表3。表2有关物质考察-系统适用性表3有关物质考察-系统适用性精密度结论：从分离度溶液可知，主峰出峰时间为12.188min，理论板数为59414，分离度为3.03，各杂质与主峰之间分离度较好，各杂质之间分离度较好；精密度试验结果保留时间和峰面积的rsd值均小于2％，表明系统适用性良好。2、专属性考察2.1分离度考察分离度溶液制备：分别取bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma和磷酸特地唑胺对照品适量，加流动相a定量稀释制成每1ml中含其他杂质均为1.25μg和磷酸特地唑胺250μg的混合溶液，作为分离度溶液。精密量取空白溶剂和分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表4。表4有关物质考察-专属性分离度考察样品保留时间(min)分离度理论板数rrtbp136.442-223800.53ddg0211.01327.04709380.91ddg1411.5613.26740420.95tdp12.1283.06587141.00bp2313.2746.03876091.09bp2513.9092.84436561.15bp2017.73017.231609641.46ina0818.2112.791879431.50ina19.4677.321991881.61bp2220.3375.012230751.68bp42-120.9543.482137891.73bp42-221.1521.082090871.74bp2626.66628.642861712.20sma34.47833.292627342.842.2强降解试验考察磷酸特地唑胺的降解研究，强降解条件包括酸、碱、氧化、高温、高湿和光照，具体降解试验如下：未破坏样品：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。碱破坏：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，加1mol/lnaoh溶液1ml，室温放置5min，用1mol/lhcl调ph至中性，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制酸碱空白。酸破坏：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，加1mol/lhcl1ml，80℃放置24h，取出，放冷至室温，用1mol/lnaoh溶液调ph至中性，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。高温破坏：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，105℃放置24h，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。光照破坏：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，4500±500lx放置24h，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。高湿破坏：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，高湿92.5％条件下放置24h，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。氧化破坏：取磷酸特地唑胺粗品约25mg，精密称定，至100ml量瓶中，加30％h2o21ml，80℃放置24h，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制氧化空白。精密量取上述各破坏溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，分别考察300nm和低波长220nm下，各样品的降解情况，结果详见说明书附图图3-图8。结果表明：a.从分离度溶液可知，各杂质与主峰均可较好的分离，且杂质之间也能较好分离，表明色谱条件专属性良好；b.粗品结果可知，样品中含有bp25(0.3106％)、bp20(0.1368％)、ina(0.4503％)、bp22(0.4461％)和bp42，纯度约为98.5405％；c.低检测波长下各样品的杂质检出个数均小于300nm波长,表明未降解出吸收较弱的杂质,从而证明采用300nm进行有关物质检测能够有效检出各降解杂质,且波长选择合理；d.在酸、碱、氧化条件下样品均有不同程度的降解，在酸条件下主要降解为ddg14、ina和bp26；氧化条件下降解为ddg01、ina和相对保留时间1.18的杂质；在碱条件下主要降解为ddg14和ina；在其他条件下降解不明显；各降解杂质与主峰和其他已知杂质均能较好的分离，表明方法专属性良好；e.各降解样品中，主峰峰纯度合格，且物料守恒计算，基本守恒，表明方法能够有效检出各降解杂质，表明方法专属性良好。3、检测限取磷酸特地唑胺、bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma适量，精密称定，用流动相a配制为适宜浓度的溶液。精密量取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察信噪比，并逐步稀释，直至信噪比≈3，为检测限浓度。根据各杂质检测限浓度，分别配制检测限的各杂质混合溶液，连续将检测限限浓度进样3针，考察各成分保留时间及峰面积变化。结果见表5-表6。表5有关物质考察-检测限样品c(μg/ml)相当于主成分(％)bp130.0300.012ddg020.0310.012ddg140.0290.012tdp0.0090.004bp230.0330.013bp250.0330.013bp200.0300.012ina080.0290.012ina0.0100.004bp220.0290.012bp420.0230.009bp260.0290.012sma0.0290.012表6有关物质考察-检测限重复性结论：各杂质的检测灵敏度高，拟定磷酸特地唑胺有关物质检查浓度为250μg/ml，进样量为10μl，各物质相当于主成分0.03％以上均能有效检出，能够满足磷酸特地唑胺有关物质检查。检测浓度连续进样3针，结果各杂质保留时间及峰面积无明显变化，表明该色谱条件能够准确检测杂质。4、定量限取磷酸特地唑胺、bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、bp42、ddg02、ddg14、ina、ina08、sma适量，精密称定，用流动相a配制为适宜浓度的溶液。精密量取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察信噪比，并逐步稀释，直至信噪比≈10，则为定量限浓度。根据各杂质定量限浓度，分别配制定量限的各杂质混合溶液，连续将定量限浓度进样6针，考察各成分保留时间及峰面积的rsd值。结果见表7-表8。表7有关物质考察-定量限样品c(μg/ml)相当于主成分(％)bp130.1000.040ddg020.1020.041ddg140.0980.039tdp0.0500.020bp230.1080.043bp250.1090.043bp200.0990.039ina080.0970.039ina0.0530.021bp220.0970.039bp420.0770.031bp260.0970.039sma0.0970.039表8有关物质考察-定量限重复性结论：各杂质的检测灵敏度高，拟定磷酸特地唑胺有关物质检查浓度为250μg/ml，进样量为10μl，相当于主成分0.05％以下均能够准确定量，能够满足磷酸特地唑胺有关物质检查。定量限浓度连续进样6针，结果各杂质保留时间及峰面积rsd值均小于5％，表明该色谱条件能够准确定量杂质。5、线性及范围杂质线性溶液：磷酸特地唑胺精制品、bp13、bp20、bp22、bp23、bp25、bp26、ddg14、ina、ina08、sma适量，精密称定，用流动相a配制浓度均为1.25、1.00、0.75、0.50、0.25、0.12μg/ml、定量限浓度的溶液。杂质ddg14线性溶液：取ddg14适量，精密称定，用流动相a配制浓度均为0.60、0.50、0.40、0.25、0.13、0.06μg/ml、定量限浓度的溶液。精密量取上述线性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度(c)为横坐标，以峰面积(a)为纵坐标，以最小二乘法计算回归方程和相关系数，并绘制标准曲线，结果见表9和说明书附图图9-图11。表9有关物质考察-线性及范围结论：从上述结果可知，各杂质及磷酸特地唑胺线性关系良好。6、精密度实验6.1重复性采用磷酸特地唑胺验证批样品，平行配制样品6份，进行有关物质测定，考察方法重复性。6份样品有关物质结果表明，方法重复性良好。6.2中间精密度不同的操作人员、不同日期和仪器，平行配制样品6份，进行有关物质测定，并结合重复性项下的6份样品结果，统计12份样品有关物质，考察方法中间精密度。结果见表10。表10有关物质考察-中间精密度结论：12份样品有关物质结果表明方法精密度良好。7、准确度溶液配制：空白样品溶液：取磷酸特地唑胺样品约25mg，精密称定，置100ml量瓶，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行两份)；自身对照溶液：精密量取空白样品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液；ddg14杂质储备液：取ddg14对照品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行两份)；ina杂质储备液：取ina对照品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶，加60％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行两份)；bp22杂质储备液：取bp22对照品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶，加60％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行两份)；tdp精制品储备液：取磷酸特地唑胺样品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行两份)；50％准确度样品：取磷酸特地唑胺样品约25mg，精密称定，置100ml量瓶，准确加入ddg14储备液150ul、ina储备液150ul、bp22储备液150ul，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行三份)；100％准确度样品：取磷酸特地唑胺样品约25mg，精密称定，置100ml量瓶，准确加入ddg14储备液300ul、ina储备液300ul、bp22储备液300ul，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行三份)；150％准确度样品：取磷酸特地唑胺样品约25mg，精密称定，置100ml量瓶，准确加入ddg14储备液450ul、ina储备液450ul、bp22储备液450ul，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行三份)；对照溶液：精密量取tdp精制品储备液500ul、ddg14储备液300ul、ina储备液300ul、bp22储备液300ul，置100ml量瓶，加流动相a稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液溶液(平行两份)；精密量取上述溶液10ul，注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表11-表13。表11准确度考察-ddg14准确度表12准确度考察-ina准确度表13准确度考察-bp22准确度结论：试验结果表明，杂质ddg14、ina、bp22的回收率结果在80％～120％之间，表明方法准确度良好。8、溶液稳定性溶液配制：供试品溶液：取磷酸特地唑胺样品、ddg14、ina、bp22适量，加流动相a溶解并定量稀释制成每1ml中含磷酸特地唑胺约250μg、ddg140.75μg、ina0.75μg、bp220.75μg的溶液，作为供试品溶液；对照溶液：取磷酸特地唑胺样品约25mg，精密称定，置100ml量瓶，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取空白溶剂、分离度溶液各10μl，注入液相色谱仪，考察各杂质的分离度；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别于0、4、8、24h进样，考察有关物质的变化，结果见表14。表14有关物质考察-溶液稳定性结论：室温放置24h，有关物质无明显变化，表明24h内溶液稳定。9、耐用性在柱温，ph、同品牌不同批次色谱柱微小变动后，对磷酸特地唑胺有关物质测定的影响，具体色谱参数见表15。表15有关物质考察-色谱参数9.1柱温精密量取分离度溶液、供试品溶液和自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察不同柱温条件磷酸特地唑胺的有关物质变化，结果如表16-表17。表16耐用性-柱温-分离度试验表17耐用性-柱温-有关物质结果柱温ina％ddg02％其他已知杂质％其他最大单杂％总杂％38度0.0850.073未检出未检出0.15840度0.0950.064未检出未检出0.15942度0.0960.063未检出未检出0.159结论：分离度结果表明，柱温在38～42℃范围内变化时，对杂质之间的分离无明显影响；有关物质结果表明，无明显区别。9.2色谱柱精密量取分离度溶液、供试品溶液和自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察不同色谱柱条件磷酸特地唑胺的有关物质变化，结果见表18-表19。表18耐用性-色谱柱-分离度试验表19耐用性-色谱柱-有关物质结果色谱柱ina％ddg02％其他已知杂质％其他最大单杂％总杂％色谱柱10.0950.064未检出未检出0.159色谱柱20.0930.063未检出未检出0.157结论：换用不同批次色谱柱，结果分离度溶液中杂质之间分离度良好；有关物质结果表明，色谱柱无明显影响。9.3不同ph精密量取分离度溶液、供试品溶液和自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察不同ph条件磷酸特地唑胺的有关物质变化，结果见表20-表21。表20耐用性-ph-分离度试验表21耐用性-ph-有关物质结果phina％ddg02％其他已知杂质％其他最大单杂％总杂％8.30.1020.068未检出未检出0.1708.50.0950.064未检出未检出0.1598.70.1060.075未检出未检出0.181结论：分离度结果表明，ph在8.3～8.7范围内变化时，对杂质之间的分离无明显影响；有关物质结果表明，无明显区别。当前第1页12