一种用于细菌群体信号分子检测细胞传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种基于电化学海藻酸钠/氧化石墨烯水凝胶细胞传感器及其制备方法，本发明属于3oc12-hsl等细菌群体信号分子检测技术领域。

背景技术：

一直以来，人们认为细菌是以单个细胞的方式生存于环境中，细菌与细菌之间不会交流，无法感知自身同一种群或者其他种群的数量变化，更不会有自发的群体行为。但近三十多年研究表明，细菌与细菌之间存在信息交流，而交流的媒介是一种小分子物质，我们称之为“信号分子”。细菌与细菌之间通过信号分子来感知自身种群的数量变化，当种群达到一定数量或浓度时，信号分子便于细胞膜或细胞质中的受体结合，激活靶基因表达与基因编码酶，改变和协调受体行为，从而实现单个微生物无法实现的生理功能和调节机制。如质粒的结合转移、生物发光、毒性因子的产生、胞外多糖形成、生物膜形成等群体行为。而n-酰基-高丝氨酸内酯(ahls)作为革兰氏阴性细菌的主要信号分子可以诱导致病因子的表达，并且群体感应(qs)系统可以在确定毒力过程中起关键作用。

食品中细菌群体信号分子是国内外检测、监控的一个重点、难点。目前细菌群体信号分子检测技术主要有以下几种：平板报告菌法、薄层层析法、高效液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法。而ahls是小分子量有机化合物，并且低浓度的ahls通常难以通过一般技术检测。鉴于现在ahls的检测方法大多以报告菌或质谱分析为主，而这些检测方法操作复杂、分析时间长、检测成本高极易出现假阴性，难以满足快速检测的要求。因此我们需要建立一种针对ahls分子真实、有效、准确的检测方法。电化学细胞传感技术为ahls检测提供了一个崭新的平台。目前已有很多关于细胞传感器的报道，但利用细胞传感器检测ahls的研究尚无先例。

基于以上现状，采用rbl-2h3肥大细胞为传感介质，通过电化学传感技术构建一系列能够快速灵敏、高效、精确对细菌所产生的ahls进行检测的细胞传感器。如能成功构建电化学传感器能够对ahls快速、精确、灵敏地检测，具有响应时间短、重复性好、稳定性高等特点，满足高通量的检测需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于电化学海藻酸钠/氧化石墨烯水凝胶细胞传感器的制备方法，并优化确定了该发明材料的使用条件。

本发明的原理是：采用rbl-2h3肥大细胞作为传感介质，利用海藻酸钠(naalg)与氧化石墨烯(go)混合制成水凝胶构建水凝胶/细胞3d培养模式，并将其接种到修饰电极完成细胞传感器的构建；最后应用于菌群信号分子中n-酰基-高丝氨酸内酯(ahls)标准物3oc12-hsl的检测。在浓度范围在0.01μm～1μm内呈良好的线性关系，检出限为0.01μm。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于细菌群体信号分子检测细胞传感器，是向海藻酸钠溶液中加入氧化石墨烯优化电导率，形成海藻酸钠/氧化石墨烯混合液，将细胞悬浮液接种到金电极表面上，并使用海藻酸钠/氧化石墨烯混合液对细胞进行覆盖、包裹，经cacl2溶液浸润后培养孵育，形成水凝胶以达到细胞固定的目的，制得海藻酸钠/氧化石墨烯修饰的电化学细胞传感器。制备的传感器应用于ahls标准物3oc12-hsl的检测。

本发明中所述细胞悬浮液是采用rbl-2h3肥大细胞作为传感介质。

本发明还公开了所述细胞传感器的制备方法，构建流程见图1，具体步骤为：

(1)氧化石墨烯的制备；

(2)海藻酸钠/氧化石墨烯混合液制备；

(3)肥大细胞的培养；

(4)水凝胶/细胞3d复合物的制备以及在电极上固定。

上述制得的细胞传感器用于ahls标准物3oc12-hsl的检测。

本发明制备方法中中各步骤的具体操作如下：

步骤(1)氧化石墨烯的制备：氧化石墨烯由天然石墨烯制备，石墨烯加入浓硫酸、硝酸钠、高锰酸钾搅拌2h，加入蒸馏水保持0.5h，加热到90℃保持0.5h，最后加入30％h2o2，直至颜色变为亮黄色并无气体产生，沉淀用5％hcl和蒸馏水过滤洗涤，将滤渣干燥后溶入水中，超声形成均匀分散液，再次烘干制得氧化石墨烯。

步骤(2)海藻酸钠/氧化石墨烯混合液制备：将0.1克氧化石墨烯与100ml的rpmi1640培养液混合，超声处理5min得到均匀的分散体，向含有1％海藻酸钠的rpmi1640培养液中滴加10％(wt％)氧化石墨烯混合液，得到海藻酸钠/氧化石墨烯混合液。

步骤(3)肥大细胞的培养：肥大细胞按10⁶ml^-1接种于六孔板中，每孔3ml培养基，置于37℃5％co2的培养箱中培养，每七天将细胞消化按照10⁶ml^-1转移到新的培养板中继续培养，细胞分化成熟后，收集细胞进行鉴定，密度控制在10⁷ml^-1左右，形成细胞悬液备用。

步骤(4)水凝胶/细胞3d复合物的制备以及在电极上固定：吸取5μl细胞悬液滴加在清洁的金电极的表面，覆盖海藻酸钠/氧化石墨烯混合液，浸入用rpmi1640培养液溶解的100mmcacl2溶液中固定1min，并放置在具有5％co2的37℃培养箱孵育，制备得到水凝胶电化学细胞传感器。

本发明还公开了所述细胞传感器用于细菌群体信号分子检测的用途。

一种用所述细胞传感器检测细菌群体信号分子的方法，即ahls标准物3oc12-hsl的检测：取出清洁的细胞传感金电极，滴加待测样品刺激后的细胞混悬液，海藻酸钠/氧化石墨烯混合液覆盖后cacl2溶液中固定，37℃孵育，然后采用微分脉冲伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极进行表征，将检测的阻抗值带入标准曲线方程y＝-1339.252x+3580.906(r²＝0.9948)中即可得到3oc12-hsl的检测结果，可以通过检测数据结果和比较3oc12-hsl的含量来确定细菌数量的多少。

所述标准曲线是通过配制一系列的3oc12-hsl标准溶液，测量用以得到不同浓度3oc12-hsl溶液的阻抗值，做标准曲线而得到(图4)。图4表明测定阻抗值与3oc12-hsl浓度在0.5～3μg/ml范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为：为y＝-1339.252x+3580.906(r²＝0.9948)，检出限为0.01μm(s/n＝3)。所示将检测的阻抗值带入标准曲线方程中即可得到3oc12-hsl的检测结果，可以通过检测数据结果和比较3oc12-hsl的含量来确定细菌数量的多少。依次滴加5μl不同浓度的3oc12-hsl标准品刺激后的细胞混悬液，海藻酸钠/氧化石墨烯混合液覆盖后cacl2溶液中固定1min，

本发明中金电极清洁方法如下：将金电极(φ＝2mm)置于piranha溶液中浸泡15min后，分别用0.3μm，0.05μm的al2o3抛光粉末，将电极表面打磨抛成镜面，再用1：1(v：v)的硝酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用。

本发明中，离心条件优选转速为800r/min，离心时间为5min；微分脉冲伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6v，振幅：0.05v；交流阻抗法条件为：初始电位：0.2v，振幅：0.05v，频率范围1-100khz。

本发明在电极表面固定细胞过程中需要构建3d细胞培养系统；通过实验寻找了合适生物相容性凝胶，选定了天然多糖海藻酸钠并利用氧化石墨烯来增强其电导率，并优化了两者的混合比例。

本发明制备的肥大细胞细胞电化学传感器检测信号分子相比传统方法具有如下优势：作为传感介质的肥大细胞本身就属于免疫系统，当细胞接触外源细菌信号分子时会发生强烈的免疫反应，表现为形态上发生脱颗粒现象，细胞释放其内容物如组胺、β-己糖胺酶、类胰蛋白酶等，因此将肥大细胞作为检测信号分子的介质来构建传感器将会大大提高检测的灵敏度和反应速度；其次通过在细胞上覆盖水凝胶形成3d结构，将细胞固定在电极上，水凝胶可以形成网孔结构将细胞保护在其中，不仅提高了细胞在电极上的粘附力而且适量添加的氧化石墨烯优化了凝胶电导率，使细胞在后续的测试中既能防止脱落又保持灵敏；

最后采用电化学测定阻抗来作为检测的信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加快了检测的速度，克服了传统方法的弊端，真真正正实现了对信号分子的快速检测。

附图说明

图1：电化学细胞传感器构建的流程图。

图2：金电极表面修饰表征循环伏安图(a)和交流阻抗图(b)

a裸金电极；b海藻酸钠/氧化石墨烯修饰后金电极；

c海藻酸钠/氧化石墨烯/细胞修饰后金电极；d海藻酸钠/细胞修饰后金电极。

图3：修饰电极表面细胞sem扫描电镜图。

图4：3oc12-hsl标准物的检测交流阻抗图。

具体实施方式

实施例1电化学细胞传感器的制备

1、氧化石墨烯的制备与海藻酸钠/氧化石墨烯混合液配置

氧化石墨烯由天然石墨烯制备，250ml烧瓶中放入石墨烯，随后加入浓硫酸、硝酸钠、高锰酸钾搅拌，维持温度在20℃，搅拌2h；加入蒸馏水，升高温度到35℃，保持0.5h；加热到90℃，保持0.5h；最后加入30％h2o2，直至颜色变为亮黄色并无气体产生。将混合物用5％hcl和蒸馏水过滤洗涤3次，将滤渣干燥后溶入水中，超声3h形成均匀分散液，再次烘干制得氧化石墨烯。将0.1克氧化石墨烯与100ml的rpmi1640培养液混合，超声处理5min得到均匀的分散体，向含有1％海藻酸钠的rpmi1640培养液中滴加10％(wt％)氧化石墨烯混合液，得到海藻酸钠/氧化石墨烯混合液。

2、细胞的培养与固定

肥大细胞按10⁶ml^-1接种于六孔板中，每孔3ml培养基，置于37℃5％co2的培养箱中培养，每七天将细胞消化按照10⁶ml^-1转移到新的培养板中继续培养，细胞分化成熟后，收集细胞进行鉴定，密度控制在10⁷ml^-1左右，吸取5μl细胞悬液滴加电极，使用海藻酸钠/氧化石墨烯混合液将细胞覆盖，cacl2溶液浸润1min，形成凝胶，37℃下孵育30min。

3、细胞传感器电化学鉴定

对制备好的细胞电化学传感器进行循环伏安和交流阻抗测试(图2)，图2结果说明对电极的修饰产生了理想的效果，同时sem扫描电镜进行表征(图3)，图3显示成功构建了凝胶/细胞3d结构。微分脉冲伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6v，振幅：0.05v；交流阻抗法条件为：初始电位：0.2v，振幅：0.05v，频率范围1-100khz。

实施例2电化学细胞传感器的应用

1、标准物的检测

称取不同质量的3oc12-hsl标准品，用dmso溶解配制。rbl-2h3细胞培养至对数生长期，消化离心，收集计数，将细胞浓度控制在10⁷cells/ml。吸取5μl细胞悬液至小离心管中，每孔依次添加终浓度为0.01μm、0.25μm、0.5μm、0.75μm、1μm、2.5μm、5μm、7.5μm、10μm的3oc12-hsl溶液，2孔一个平行，置于细胞培养箱内温育30分钟。取出已清洁打磨完成的细胞传感电极，依次滴加5μl不同浓度的3oc12-hsl标准品刺激后的细胞悬液，覆盖海藻酸钠/氧化石墨烯混合液，cacl2溶液中固定1min37℃孵育5min后，将电极插电解池中进行测量。

2、分析条件与方法

分析方法如下：电化学工作站atuolab在初幅0.05v，频率为1～100khz的条件下，在反应介质液为2.5mmolfe(cn)6^3-/4-溶液中进行测量，采用eis法，并通过最佳等效电路计算，以工作电极滴加了0μm3oc12-hsl的细胞悬液的阻抗值作为空白交流阻抗值ret(ab)，以此电极与含有不同浓度3oc12-hsl标准品刺激后的细胞在同一电解液中所测阻抗值为ret(ab-ag)，求出在不同3oc12-hsl标准品浓度中ret的变化值δret：

δret＝ret(ab-ag)-ret(ab)

ret(ab)：空白交流阻抗值；

ret(ab-ag)：与3oc12-hsl刺激后的细胞的电极电子传递电阻值；

δret：反应前后极电子传递电阻的变化值；

以电子传递电阻的变化值和3oc12-hsl标准溶液浓度的关系作图，即得3oc12-hsl细胞传感器的检测标准曲线。

3、结果判断

通过配制一系列的3oc12-hsl标准溶液，测量用以得到不同浓度3oc12-hsl溶液的阻抗值，做标准曲线(图4)。图4表明测定阻抗值与3oc12-hsl浓度在0.5～3μg/ml范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为：为y＝-1339.252x+3580.906(r²＝0.9948)，检出限为0.01μm(s/n＝3)。所示将检测的阻抗值带入标准曲线方程中即可得到3oc12-hsl的检测结果，可以通过检测数据结果和比较3oc12-hsl的含量来确定细菌数量的多少。

使用本方法可以在10分钟内快速测定微量级别的3oc12-hsl，灵敏度高、准确性好，因此可以为快速定量检测与鉴定食品中存在的细菌进行提供技术支持。