一种改进的免疫组织化学试验方法与流程

文档序号：12033428阅读：1003来源：国知局

本发明属于生物医学技术领域，具体地，涉及一种改进的免疫组织化学试验方法。

背景技术：

免疫组织化学（immunohistochemistry）又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。目前主流的生物或医学基础研究中，免疫组织化学是一种较为常用的试验方法，在现有技术中，其具体操作步骤为：（1）将生物标本制作成石蜡切片，石蜡切片置于烤箱中60℃烤片2小时，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脱蜡，每次15分钟；（2）然后将切片依次放入无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分钟；蒸馏水洗3分钟；（3）pbs洗涤切片3次，每次3分钟；（4）抗原修复：将组织切片置于盛满edta抗原修复缓冲液（ph8.0）的修复盒中放入微波炉内进行抗原修复。依次中火8分钟，停火8分钟，然后中低火7分钟，此修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，以免干片；（5）自然冷却至室温后，将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；（6）阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液中，室温避光孵育25分钟；（7）将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；（8）切片稍甩干后滴加相关动物血清覆盖组织，室温封闭30分钟；（9）加一抗：甩掉血清封闭液并滴加按一定比例临时配制好的一抗覆盖组织，切片平放于湿盒内4°c孵育过夜；（10）湿盒4℃冰箱取出后恢复至室温；（11）将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；（12）加二抗：切片稍甩干后滴加与一抗相对应的二抗（生物素标记）覆盖组织，置于湿盒内室温孵育50分钟；（13）然后将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；（14）切片稍甩干并滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育25分钟；（15）将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；（16）dab显色：切片稍甩干后滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，显色后自来水冲洗切片终止显色；（17）harris苏木素复染3分钟左右，自来水冲洗；（18）1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗；（19）脱水透明：将切片依次放入70%酒精5分钟、80%酒精5分钟、90%酒精5分钟、95%酒精5分钟、无水乙醇ⅰ、ⅱ各5分钟、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分钟中脱水透明；（20）将切片从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片。

现有的试验方法试验结果理想，但操作步骤相对较多，试验过程耗时相对较长。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有免疫组织化学存在的缺陷和不足，提供一种改进的免疫组织化学试验方法。本发明通过对传统免疫组化顺序一抗、二抗标记后，需要链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵化显色过程进行改进，利用新型复合抗体为二抗孵育，后可直接进行显色步骤，在保证试验结果的同时简了化试验步骤，缩短了试验时长。

本发明的目的是提供一种改进的免疫组织化学试验方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种改进的免疫组织化学试验方法，包括如下步骤：

s1.生物标本制成石蜡切片脱蜡至水，再抗原热修复；

s2.将切片置于3%h2o2中温室25min内灭活内源性酶；

s3.切片经相关动物血清封闭；

s4.除去封闭液，用一抗稀释液4℃孵育过夜；

s5.用hrp标记的二抗孵育一抗；

s6.切片再经dab显色，显色终止后复染；

s7.切片脱水透明，最后封片。

优选地，步骤s1所述脱蜡至水为石蜡切片置于烤箱中60℃烤片2小时，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脱蜡，每次15分钟；然后将切片依次放入无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分钟，再蒸馏水洗3分钟；最后用pbs洗涤切片3次，每次3分钟。

优选地，步骤s1所述抗原热修复为将组织切片置于ph8.0的edta抗原修复缓冲液中，然后放入微波炉内进行抗原修复，依次中火8分钟，停火8分钟，然后中低火7分钟，此修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，以免干片。

优选地，步骤s3所述封闭为室温封闭30分钟。

优选地，步骤s5所述孵育为室温孵育50分钟。

优选地，步骤s6所述dab显色为切片稍甩干后滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，显色后自来水冲洗切片终止显色。

优选地，步骤s8所述脱水透明为将切片依次放入70%酒精5分钟、80%酒精5分钟、90%酒精5分钟、95%酒精5分钟、无水乙醇ⅰ、ⅱ各5分钟、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分钟中脱水透明。

作为一种优选的实施方式，本发明所述改进的免疫组织化学试验方法具体包括如下步骤：

（1）将生物标本制作成石蜡切片，石蜡切片置于烤箱中60℃烤片2小时，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脱蜡，每次15分钟；

（2）然后将切片依次放入无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分钟；蒸馏水洗3分钟；

（3）pbs洗涤切片3次，每次3分钟；

（4）抗原修复：将组织切片置于盛满edta抗原修复缓冲液（ph8.0）的修复盒中放入微波炉内进行抗原修复。依次中火8分钟，停火8分钟，然后中低火7分钟，此修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，以免干片；

（5）自然冷却至室温后，将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；

（6）阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液中，室温避光孵育25分钟；

（7）将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；

（8）切片稍甩干后滴加相关动物血清覆盖组织，室温封闭30分钟；

（9）加一抗：甩掉血清封闭液并滴加按一定比例临时配制好的一抗覆盖组织，切片平放于湿盒内4°c孵育过夜；

（10）湿盒4℃冰箱取出后恢复至室温；

（11）将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；

（12）加二抗：切片稍甩干后滴加与一抗相对应二抗（hrp标记）覆盖组织，置于湿盒内室温孵育50分钟；

（13）然后将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；

（14）dab显色：切片稍甩干后滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，显色后自来水冲洗切片终止显色；

（15）harris苏木素复染3分钟左右，自来水冲洗；

（16）1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗；

（17）脱水透明：将切片依次放入70%酒精5分钟、80%酒精5分钟、90%酒精5分钟、95%酒精5分钟、无水乙醇ⅰ、ⅱ各5分钟、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分钟中脱水透明；

（18）将切片从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

（1）本发明通过对传统免疫组化顺序一抗、二抗标记后，需要链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵化显色过程进行改进，利用新型复合抗体为二抗孵育，后可直接进行显色步骤，在保证试验结果的同时简了化试验步骤，缩短了试验时长。

（2）本发明该进后的方法简化了试验步骤，缩短了试验时间，从而使研究者有条不紊的试验，加快了试验进度，可用于生物医学研究领域，具有较大的应用前景。

附图说明

图1免疫组化的试验流程；a为传统方法试验流程，b为改进方法试验流程。

图2为免疫组化的实验结果；a为传统免疫组化，b为改进后的免疫组；a与b所得实验效果相同，但改进后的免疫组化在保证试验结果的同时简化试验步骤。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种改进的免疫组织化学试验方法

免疫组化的具体操作步骤如下：