检测肿瘤标志物的流式检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医学检测领域，具体而言，涉及一种检测肿瘤标志物的流式检测试剂盒。

背景技术：

单核-巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞、以及组织内的巨噬细胞。人类外周血细胞主要分为无核细胞(主要为血红细胞)和有核细胞(白细胞等)。单核细胞约占有核细胞总数的5％左右，由髓系造血祖细胞分化而来，是免疫系统中抗原递呈细胞(apc细胞)的重要组分。

在人体外周循环血液中，白细胞分布在两个地方，即循环池和储存池，循环池就是流动血液中的白细胞，储存池就是附着在血管壁，淋巴结，骨髓等处的白细胞，暂时不参与血液循环，但储存池中的白细胞与循环池中的白细胞保持动态平衡。白细胞在人体循环系统内成熟分化并实现免疫学功能可以大致分为以下步骤：毛细血管中的单核细胞→透过血管壁进入血管外组织→发现异源性物质(细菌、病原体、肿瘤细胞等)→分化为成熟的巨噬细胞→吞噬并消化→将抗原递呈到特定的细胞表面分子上→经由淋巴管回流到外周血→完成抗原递呈激活杀伤性免疫细胞。

作为机体抗击外来病原侵袭和清楚自身非正常细胞机制的哨兵，巨噬细胞是免疫系统形成免疫应答的重要环节，作用重大。在正常人体内每时每刻都有向着肿瘤化(永生化、非正常凋亡)发展的细胞产生，正常的机体免疫机制可以通过上述过程，将其及时清除。由此可见无论健康人群还是癌症患者体内巨噬细胞对于肿瘤化细胞的吞噬作用，都是无时无刻不在进行的，针对单核-巨噬细胞内肿瘤来源物质(包括蛋白质、核算、脂类等)的观测，可以为我们提供一个监控体内肿瘤发生、发展的崭新视角，其应用前景必然非常广泛。

单核-巨噬细胞作为有核细胞的重要组分，实验室一般是通过其表面抗原分子cd14和cd16进行检测的，目前可以买到成熟的抗体。主要的临床应用集中在血细胞组成检测和造血系统肿瘤(如：粒/单核细胞性白血病)方面的检测中，为临床诊断提供重要参考。但将其与实体肿瘤的监控相联系，就目前专利和文献检索来看，仍然缺少足够多的系统性的相关研究，且尚未形成成熟产品，在中国大陆地区也没有相关专利授权。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测肿瘤标志物的流式检测试剂盒，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种检测肿瘤标志物的流式检测试剂盒，包括用以标记细胞膜表面抗原的cd14抗体和cd16抗体，以及用以标记胞浆内部抗原的抗体；

所述胞浆内部抗原为tktl1和/或dnase1l1。

本发明的原理为，用cd14和cd16的抗体标记出待检测对象外周血中的cd14⁺cd16⁺细胞，去除除白细胞之外的大部分杂质后用待检测的抗肿瘤标志物x(即上述的胞浆内部抗原)的抗体标记该肿瘤标志物；

用流式细胞仪检测x⁺cd14⁺cd16⁺细胞与cd14⁺cd16⁺的细胞数量并统计前者与后者细胞数量的比值。

流式细胞术(flowcytometry，fcm)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。通过使用流式细胞术对cd14⁺cd16⁺及x⁺cd14⁺cd16⁺阳性细胞的数量进行检测，可以快速、精度地评价全局肿瘤标志物表达水平。

目前已经确定人类外周血中存在不同亚型的单核细胞。已知的主要根据cd14和cd16抗原的表达分为4个亚型：cd14⁺⁺cd16^－(g1亚型)，cd14⁺⁺cd16⁺(g2亚型)，cd14⁺cd16^－(g3亚型)，cd14⁺cd16⁺(g4亚型)。cd14⁺cd16⁺是其中最主要的亚型之一，其比其他亚型的单核细胞具有更强的吞噬能力，因而从本发明的原理角度来讲，检测cd14⁺cd16⁺亚型的单核细胞更有意义。

肿瘤标志物(tm)，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。当cd14⁺cd16⁺细胞吞噬肿瘤细胞时，肿瘤标志物便会在cd14⁺cd16⁺细胞富集，而cd14⁺cd16⁺细胞是在人体内循环运动的，因而可通过检测cd14⁺cd16⁺细胞中肿瘤标志物含量来方便的表征人体内的肿瘤标志物水平。

肿瘤细胞与正常体细胞的差异，最主要在两个方面：

物质代谢：肿瘤细胞由于其增殖快并且不受正常细胞周期调控，往往表现出对能量物质(葡萄糖等)的饥渴式的需求，但由于其代谢机制的变异，物质代谢特别是能量代谢效率往往远低于正常体细胞，例如，不能对葡萄糖进行完全有效的代谢利用，而是一种浪费式的消耗。而肿瘤细胞在此代谢过程中所需要的酶类物质，其表达量与正常体细胞也存在巨大的差异，可以将其作为肿瘤细胞检测的突破点。

细胞凋亡：肿瘤细胞区别于正常体细胞的另一个特点就是永生化，肿瘤细胞是不受正常细胞周期调控的。细胞凋亡机制已经有了较为清晰的研究，肿瘤细胞不凋亡，那必然导致调控细胞凋亡或者在细胞凋亡过程中起到关键作用的因子、信号物质或者酶的表达量出现明显异常，这同样可以作为肿瘤细胞检测的突破点。

本发明所优选的两个肿瘤标志物即分别与物质代谢与细胞凋亡相关。

tktl1(transketolase1)为转酮醇酶1，它、主要调节糖代谢途径中的非氧化途径，在多种肿瘤中高表达，其表达量与肿瘤的发展阶段，侵袭和转移，以及预后有密切关系。对肿瘤患者的营养搭配及后续的治疗等方面有着重要的提示作用。

dnase1l1(deoxyribonucleasei-linke1)在细胞凋亡过程中起重要作用，但在肿瘤细胞中，正常的凋亡机制失效，dnase1l1活性受到抑制，但其大量表达并在肿瘤细胞中积累。其表达量可作为鉴别肿瘤细胞或凋亡机制异常细胞的指标。

优选的，如上所述的流式检测试剂盒，所述流式检测试剂盒还包括所述cd14抗体、cd16抗体和胞浆内部抗原的抗体中的一种或多种抗体对应的荧光二抗。

进一步优选的，所述荧光二抗为f(ab')2抗体。

本发明需要标记cd14⁺cd16⁺细胞胞浆内部的tktl1和/或dnase1l1抗原，由于f(ab')2抗体没有fc段，穿透细胞膜的能力更强，特异性更好，因而优选f(ab')2抗体用作荧光二抗。

同时，为了减少操作步骤，优选的，所述cd14抗体、cd16抗体和胞浆内部抗原的抗体均为荧光标记抗体，且荧光颜色均不同。

进一步的，无论对于荧光二抗还是荧光一抗，优选的，所述荧光标记为pe、cy5、cy7、per-cp以及tritc中的任一种。

优选的，如上所述的流式检测试剂盒，所述流式检测试剂盒还包括与所述胞浆内部抗原的抗体同种属来源的igg抗体。

同种属来源的igg抗体的作用在于，可标记与胞浆内部抗原的抗体非特异结合的非特异性物质，因而可将其信号作为本底信号扣除，具体见本发明实施例。

优选的，如上所述的流式检测试剂盒，所述流式检测试剂盒还包括裂解液、封闭和打孔缓冲液、固定液、漂洗液中的任意一种或多种。

进一步优选的，所述裂解液为含有以下浓度各成分的工作液或其母液：

8mm～12mmtris-hcl、8mm～12mmnah2po4和/或nahpo4、120mm～140mmnacl、体积百分数为0.7％～1.3％的tritonx-100、8mm～12mmna4p2o7·10h2o，ph＝7.2～7.7。

进一步优选的，所述封闭和打孔缓冲液为含有以下浓度各成分的工作液或其母液：

0.008g/ml～0.012g/ml的bsa和体积百分数为0.7％～1.3％的tritonx-100溶液，溶剂为1×tbs或1×pbs溶液。

进一步优选的，所述固定液为含有以下浓度各成分的工作液或其母液：

以体积百分数计，含有0.8％～1.2％的甲醛和0.33％～0.38％甲醇的混合溶液，所用溶剂为水。

进一步优选的，所述漂洗液为含有以下浓度的各成分的工作液或其母液：

1×pbs溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明提供了检测肿瘤抗原的试剂盒，该试剂盒针对血液中的tktl1和dnase1l1进行检测，进而获知待测对象全局肿瘤抗原的表达水平，因而可用于肿瘤的早期诊断。

2)、流式细胞术(flowcytometry，fcm)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。流式细胞术结合本发明的试剂盒可以快速、精度地评价全局肿瘤标志物表达水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为流式细胞术的部分结果图；图1a为总体单核细胞，图1br2框出的范围为cd14⁺cd16⁺细胞；

图2为实施例1的部分检测结果图；图2a为对照组，图2b为dnase1l1，图2c为tktl1；

图3为实施例2的部分检测结果图；图3a为对照组，图3b为dnase1l1，图3c为tktl1。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、取外周血血液样本1，吸取200ul，加入抗体anti-cd14-fitc(bd公司，货号555397)40ul，anti-cd16-apc(bd公司，货号561304)10ul，室温避光孵育15min；

2、加入200ul固定剂室温避光孵育8min；所述固定剂的成分为：体积百分数为0.8％的甲醛，体积百分数为的0.30％甲醇；

3、加裂解液3ml到样品中，涡旋震荡混匀，避光孵育15min，裂解红细胞；所述裂解液含有8mmtris-hcl、8mmnah2po4和/或nahpo4、140mmnacl、体积百分数为1.3％的tritonx-100、8mmna4p2o7·10h2o，ph＝7.2；

4、700g离心6min，去除上清；缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡重悬细胞；

5、加入80ul封闭和打孔缓冲液，指弹混匀；

所述封闭和打孔缓冲液为0.012g/ml的bsa和体积百分数为1.3％的tritonx-100溶液；溶剂为1×tbs溶液。

6、将上述溶液体系平分为两份，分别加入anti-tktl1(rabbitpolyclonal，sigma，货号hpa000505)和anti-dnase1l1抗体(rabbitpolyclonal，sigma，货号hpa072635)，指弹混匀，避光孵育20min；抗体的添加比例均为1:1000；

7、分别加入2mlpbs(8g/lnacl、0.2g/lkcl、1.4g/lna2hpo4、0.27g/lkh2po4)洗，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗2～3次，洗完后重悬细胞；

8、分别加入2ulanti-rabbit-peantibody(donkeypolyclonal，abcam公司，货号ab7007)，避光孵育10min；

9、分别加入2mlpbs洗，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗2～3次，洗完后重悬细胞；

10、分别用500ulpbs重悬细胞，流式细胞仪检测。

实施例2

1、取外周血血液样本2，吸取200，加入抗体anti-cd14-fitc(bd公司，货号555397)40ul，anti-cd16-apc(bd公司，货号561304)10ul，室温避光孵育15min；

2、加入200ul固定剂室温避光孵育6min；所述固定剂的成分为：体积百分数为1.2％的甲醛，体积百分数为的0.38％甲醇；

3、加裂解液3ml到样品中，涡旋震荡混匀，避光孵育15min，裂解红细胞；所述裂解液含有12mmtris-hcl、12mmnah2po4和/或nahpo4、120mmnacl、体积百分数为0.7％的tritonx-100、12mmna4p2o7·10h2o，ph＝7.7；

4、900g离心4min，去除上清；缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡重悬细胞；

5、加入120ul封闭和打孔缓冲液，指弹混匀；

所述封闭和打孔缓冲液为0.008g/ml的bsa和体积百分数为0.7％的tritonx-100溶液；溶剂为1×pbs溶液。

6、将上述溶液体系平分为两份，分别加入anti-tktl1(rabbitpolyclonal，sigma，货号hpa000505)和anti-dnase1l1抗体(rabbitpolyclonal，sigma，货号hpa072635)，指弹混匀，避光孵育15min；抗体的添加比例均为1:1000；

7、分别加入2mlpbs(8g/lnacl、0.2g/lkcl、1.4g/lna2hpo4、0.27g/lkh2po4)洗，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗2～3次，洗完后重悬细胞；

8、分别加入2ulanti-rabbit-peantibody(donkeypolyclonal，abcam公司，货号ab7007)，避光孵育10min；

9、分别加入2mlpbs洗，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗2～3次，洗完后重悬细胞；

10、分别用500ulpbs重悬细胞，流式细胞仪检测。

对实施例1～2的结果进行检测。统计时，先从所有的单核细胞(图1a)中框出cd14⁺cd16⁺的细胞(图1b，r2框出的范围)；再从r2框中框出cd14⁺cd16⁺dnase1l1⁺或cd14⁺cd16⁺tktl1⁺的细胞(图2和图3)；其中，对照组(图2a和图3a)的做法为，将anti-tktl1或anti-dnase1l1抗体替换为同种属来源的igg抗体；其余步骤与实验组一致。

表1实施例1和实施例2检测结果(gci值)

其中，表格中检测值分别为：

对照组：(cd14⁺cd16⁺igg⁺÷cd14⁺cd16⁺)×1000；

dnase1l1组：(cd14⁺cd16⁺dnase1l1⁺÷cd14⁺cd16⁺)×1000；

tktl1组：(cd14⁺cd16⁺tktl1⁺÷cd14⁺cd16⁺)×1000；

最终值即gci(globlecancerationindex，全局癌变指数)值，其算法为各组的检测值减去对照组的检测值。

正常和疾病的分界线值是通过大量的临床数据确定的，前期的数据是

tktl1：小于119正常，大于119分有肿瘤风险；

dnase1l1：0-100正常，100-130建议全面检测，130以上有肿瘤风险；

最终结果综合tktl1与dnase1l1两组的综合gci值进行考量。

实施例3

1、将外周血血液样本3，吸取200ul，加入抗体anti-cd14-fitc(bd公司，货号555397)40ul，anti-cd16-apc(bd公司，货号561304)10ul，室温避光孵育15min；

2、加入200ul固定剂室温避光孵育5min；所述固定剂的成分为：体积百分数为1％的甲醛，体积百分数为的0.35％甲醇；

3、加裂解液3ml到样品中，涡旋震荡混匀，避光孵育15min，裂解红细胞；所述裂解液含有10mmtris-hcl、10mmnah2po4和/或nahpo4、130mmnacl、体积百分数为1％的tritonx-100、10mmna4p2o7·10h2o，ph＝7.5；

4、800g离心5min，去除上清；缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡重悬细胞；

5、加入100ul封闭和打孔缓冲液，指弹混匀；

所述封闭和打孔缓冲液为0.01g/ml的bsa和体积百分数为1％的tritonx-100溶液；

6、在上述溶液体系中加入荧光标记的anti-tktl1(抗体购自rabbitpolyclonal，sigma，货号hpa000505，自己加荧光标记)和荧光标记的anti-dnase1l1抗体(抗体购自rabbitpolyclonal，sigma，货号hpa072635，自己加荧光标记)，指弹混匀，避光孵育15～20min；抗体的添加比例均为1:1000；注意荧光标记的anti-tktl1和荧光标记的anti-dnase1l1抗体的应该颜色与anti-cd14-fitc和anti-cd16-apc(bd公司，货号561304)的荧光颜色不同。

7、分别加入2mlpbs(8g/lnacl、0.2g/lkcl、1.4g/lna2hpo4、0.27g/lkh2po4)洗，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗2～3次，洗完后重悬细胞；

8、用500ulpbs重悬细胞，流式细胞仪检测。

实验例

取外周血血液样本3平分为四组，每组3份，用实施例1～3及对比例中记载的方法进行检测，每组重复三次；其中对比例的设置方式为：在实施例3的基础上去除加裂解液裂解红细胞并离心去除杂质的步骤，其余操作同实施例3(即用全血进行检测)。

表2检测结果(gci值)

从上表可知，实施例1～3中记载的方法检测稳定性较好，且重复性好，而对比例三次检测的浮动较大，且最终值远低于实施例，推测可能的原因是由于没有去除杂质，抗体非特异性结合较多，导致cd14⁺cd16⁺值上升，而肿瘤标志物的抗体可能特异性更好一些，所以cd14⁺cd16⁺x⁺变化不大，进而使得gci值整体下降，造成假阴性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。