大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌共检测试纸及其制备方法与应用与流程

本发明属于食品安全中食源性致病微生物检测领域，涉及一种基于纳米酶的免疫层析试纸的制备方法，以铂钯纳米颗粒代替传统的胶体金作为信号元件以提高灵敏度，以平行双通道设计代替单条多检测线设计以提高特异性，建立一种灵敏度强、特异性好的生物传感器检测技术，用于常见的食源性致病菌大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的现场快速检测。

背景技术：

纳米酶是近年来发现的一种在生物传感器构建中性能良好的信号元件，因这类纳米颗粒具有酶的催化活性而得名。通常，基于纳米酶的生物传感器可以提高灵敏度、降低最低检出限，源于纳米酶不仅可以提供纳米材料本身的颜色作为信号，还可以在加入反应底物都生产另外的颜色以提高信号强度。在众多纳米酶中，铂钯纳米颗粒是一种具有类辣根过氧化物酶活性的材料，具有催化活性强、比表面积大、稳定性强的特点。

食源性病原菌严重威胁到人类的健康和生命，每年有很多人因此生病、住院甚至死亡，而且由于很多致病菌的感染剂量非常低(例如肠出血性大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的感染剂量低至10个细胞)，所以简单、快速、灵敏、可靠地检测细菌对人类的生命健康至关重要。然而传统的检测方法，例如培养的方法、酶联免疫吸附法(elisa)具有耗时长、灵敏度低等缺点，而pcr的方法灵敏度虽然高，但是通常需要进行样品前处理而且需要专业人员操作且步骤较繁琐从而限制了其应用，迫切需要更为灵敏、快速的检测技术。另外，如果能够实现在一个检测平台上对这两种致病菌同时检测，将会为食品安全和人类健康提供重要的技术保障。试纸是一种便携、廉价、简单、快速的检测平台，已经广泛应用在验孕领域，并在食品安全和环境监测领域有很多初步的尝试。但是，这些试纸一般采用胶体金颗粒作为信号元件，使得灵敏度较差；另外，在多靶标检测的检测中均采用单条多检测线的设计，使得交叉反应难以克服。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强的试纸条制备方法，用于同时大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌。为了提高试纸的检测灵敏度，本发明以铂钯纳米颗粒代替传统的胶体金作为信号元件；为了提高多重试纸的特异性，本发明采用了平行双通道设计。

本发明采用以下技术方案：

一种大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌共检测试纸，包括底板；附着在所述底板上的样品垫；平行设置在所述底板上且(除所述样品垫外)互不接触的第一吸收性条带和第二吸收性条带；

所述第一吸收性条带和第二吸收性条带分别包括依次附着于所述底板上的结合垫、反应膜和吸水垫；所述反应膜的一端与所述结合垫相连、另一端与所述吸水垫相连；所述第一吸收性条带和第二吸收性条带的结合垫分别与所述样品垫相连；

其中一条吸收性条带的结合垫上包被有铂钯纳米颗粒-鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体复合物，反应膜上靠近所述结合垫的一端设置有测试线、靠近所述吸水垫的一端设置有质控线，所述测试线上包被羊源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体，所述质控线上包被羊抗鼠igg抗体；

其中另一条吸收性条带的结合垫上包被有铂钯纳米颗粒-鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体复合物，反应膜上靠近所述结合垫的一端设置有测试线、靠近所述吸水垫的一端设置有质控线，所述测试线上包被羊源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体，所述质控线上包被羊抗鼠igg抗体。

进一步地，羊源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml，优选为1.0mg/ml。

进一步地，羊源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml，优选为1.0mg/ml。

进一步地，所述羊抗鼠igg抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml，优选为0.5mg/ml。

进一步地，所述样品垫为三角形，其底边与所述结合垫相连。

进一步地，所述两条吸收性条带的结合垫可以相连或接触。

进一步地，所述试纸还可包括覆盖于所述样品垫上和/或覆盖于所述吸水垫上的固定膜。所述固定膜可以促进试纸中各组件的稳固性，优选为防水材质例如pe保护膜。所述固定膜还具有避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应的作用。

进一步地，所述样品垫和所述反应膜具有1-2mm左右的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有1-2mm左右的重叠区。重叠区保证了样品液流动的连续性，使反应能够充分发生，有效地降低了实验误差。

进一步地，所述底板为pvc材料或塑料材质；所述样品垫、结合垫、反应膜均可为硝酸纤维膜或玻璃纤维棉；所述吸水垫可为吸水性材料，例如吸水纸。

所述样品垫可为玻璃纤维棉。所述反应膜可为硝酸纤维素膜。所述吸水垫可为吸水纸。所述保护膜可为pe保护膜。所述样品板可为塑料材质。

进一步地，所述试纸中，所述样品垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。

所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。

所述样品垫的长度(自始端至末端)可为18mm，所述反应膜的长度(自始端至末端)可为20mm，所述吸水垫的长度(自始端至末端)可为20mm。所述检测线距离所述样品垫的垂直距离可为6mm，所述质控线距离所述吸水垫的垂直距离可为6mm。

进一步地，检测线和质控线均与所述反应膜的轴线垂直。

其中铂钯纳米颗粒-鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体复合物以及铂钯纳米颗粒-鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体复合物的制备方法如下：

1)铂钯纳米颗粒的制备

首先，配置20mm的四氯铂酸钾溶液(k2ptcl4)、20mm的四氯钯酸钠溶液(na2pdcl4)、6m的盐酸溶液和100mm的抗坏血酸溶液。然后，称取20mgf127溶解于1.8ml四氯铂酸钾溶液(20mm)中，再加入0.2ml四氯钯酸钠溶液(20mm)，超声3-5min使f127完全溶解。继续加入44μl的hcl(6m)和2ml的抗坏血酸溶液(100mm)，超声处理4小时。在13000rpm离心5分钟后，吸取去上清后用丙酮洗涤沉淀，重复三次。最后，再将沉淀物溶解于5ml的水中，所得即为铂钯纳米颗粒。可放置在4℃冰箱保存。

2)铂钯纳米颗粒-抗体复合物的制备

首先，配置0.02m的碳酸钾溶液、pbs稀释的1mg/ml的鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体溶液、pbs稀释的1mg/ml的鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体溶液、2％的牛血清白蛋白溶液、10％的牛血清白蛋白溶液和复溶液(2％的牛血清白蛋白和3％的蔗糖)。

然后将上述步骤1)合成的铂钯纳米颗粒用水稀释20-50倍，用0.02m的碳酸钾溶液调节ph至8.2-8.5。取1ml上述溶液，加入5μl-10μl的鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体溶液或鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体溶液，在室温下震荡1h。继而加入110μl的牛血清白蛋白溶液(10％)，得到溶液中的牛血清白蛋白终浓度为1％，并在室温下震荡30min。在10000rpm离心20分钟后，吸取去上清后用牛血清白蛋白溶液(2％)清洗，重复三次。最后，再将沉淀物溶解于100μl的复溶液中，所得即为铂钯纳米颗粒-鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体复合物或铂钯纳米颗粒-鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体复合物。可放置在4℃冰箱保存。

上述大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌共检测试纸的组装方法简述如下：

该试纸包括一个三角形样品垫、两个结合垫、两条硝酸纤维素膜(反应膜)、两个吸水垫和一张底板。样品垫的材料是硝酸纤维素膜，用1×pbs溶液(含有1％的bsa和0.25％的tween-20)浸泡，然后在室温下过夜干燥。其中一条硝酸纤维素膜喷涂兔源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体(作为检测线s)溶液(1.0mg/ml)和羊抗鼠igg抗体(作为质控线e)溶液(0.5mg/ml)。

其中另一条硝酸纤维素膜喷涂兔源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体(作为检测线s)溶液(1.0mg/ml)和羊抗鼠igg抗体(作为质控线e)溶液(0.5mg/ml)。

将结合垫分别喷涂上述方法制备的铂钯纳米颗粒-鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体复合物、铂钯纳米颗粒-鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体复合物。

然后在37℃下干燥过夜并在4℃下储存。

将样品垫、两个结合垫、两条硝酸纤维素膜(反应膜)和两个吸水垫依次组装在底板上，重叠约1-2mm。使用切纸机将单条试纸切割成宽度为4mm后，将具有不同检测线(s或e)的两条试纸组装在三角形样品垫上，组装的双通道试纸可以立即使用或在室温的干燥条件下储存。

本发明大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌共检测试纸的使用方法：将90μl缓冲液(含有0.25％tween-20的pbs)与10μl待测样品溶液混合，然后滴加到双通道试纸的三角形样品垫中，并由在毛细管力的作用下迁移。1分钟后，肉眼可见的黑线出现在相应的线上。加入1μl的tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液后，在10分钟内双通道试纸的线上可以观察到增强的蓝色信号。

本发明提供了一种灵敏度高、特异性强的检测试纸，以铂钯纳米颗粒代替传统的胶体金作为信号元件以提高灵敏度，以平行双通道设计代替单条多检测线设计以提高特异性，可用于同时检测大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌。

本发明的优点；

1、首次建立了一种纳米酶试纸用于同时检测大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌。

2、以铂钯纳米颗粒代替传统的胶体金作为信号元件，提高了试纸的灵敏度。

3、以平行双通道设计代替单条多检测线设计，提高了试纸的特异性。

4、建立了一个灵敏度强、特异性好的生物传感器检测技术，用于食源性致病菌的双靶标检测。

5、方法具有通用型，仅需根据检测对象更换抗体，就能实现最终的现场可视化检测。

6、针对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌o157:h7的检测能够达到10cfuml^-1。

附图说明

图1为实施例1铂钯纳米颗粒合成示意图；

图2为实施例1透射电镜(tem)表征图；

图3为实施例1试纸结构示意图；

图4表示本发明试纸检测大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度；

图5表示本发明试纸检测大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的特异性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌共检测试纸的制备及组装

1、铂钯纳米颗粒的制备

制备过程中所需的玻璃器皿都必须在新鲜配制的王水(hno3:hcl＝3:1)中浸泡30分钟后，用大量的双蒸水冲洗并在烘烤箱中烘干备用。

首先，配置20mm的四氯铂酸钾溶液(k2ptcl4)、20mm的四氯钯酸钠溶液(na2pdcl4)、6m的盐酸溶液和100mm的抗坏血酸溶液。然后，称取20mgf127溶解于1.8ml四氯铂酸钾溶液(20mm)中，再加入0.2ml四氯钯酸钠溶液(20mm)，超声5min使f127完全溶解。继续加入44μl的hcl(6m)和2ml的抗坏血酸溶液(100mm)，超声处理4小时。在13000rpm离心5分钟后，吸取去上清后用丙酮洗涤沉淀，重复三次。最后，再将沉淀物溶解于5ml的水中，所得即为铂钯纳米颗粒。放置在4℃冰箱保存。图1为铂钯纳米颗粒合成的示意图。图2为透射电镜(tem)表征图，其中，图2a为铂钯纳米颗粒的透射电镜(tem)表征图，(a)铂钯纳米颗粒；(b)抗体修饰的铂钯纳米颗粒；(c1和c2)大肠杆菌与大肠杆菌抗体修饰的铂钯纳米颗粒相结合；(d1和d2)沙门氏菌与沙门氏菌抗体修饰的铂钯纳米颗粒相结合。

2、铂钯纳米颗粒-抗体复合物的制备

首先，配置0.02m的碳酸钾溶液、pbs稀释的1mg/ml的鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体溶液、pbs稀释的1mg/ml的鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体溶液、2％的牛血清白蛋白溶液、10％的牛血清白蛋白溶液和复溶液(2％的牛血清白蛋白和3％的蔗糖)。

然后将上述合成的铂钯纳米颗粒用水稀释20倍，用0.02m的碳酸钾溶液调节ph至8.5。取1ml上述溶液，加入5μl的鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体溶液或鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体溶液，在室温下震荡1h。继而加入110μl的牛血清白蛋白溶液(10％)，得到溶液中的牛血清白蛋白终浓度为1％，并在室温下震荡30min。在10000rpm离心20分钟后，吸取去上清后用牛血清白蛋白溶液(2％)清洗，重复三次。最后，再将沉淀物溶解于100μl的复溶液中，所得即为铂钯纳米颗粒-鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体复合物或铂钯纳米颗粒-鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体复合物。放置在4℃冰箱保存。

图2b是抗体修饰的铂钯纳米颗粒的透射电镜(tem)表征图，在纳米颗粒表面有一圈透明的光斑，表示抗体已经成功修饰在铂钯纳米颗粒表面。图c1和c2是大肠杆菌与大肠杆菌抗体修饰的铂钯纳米颗粒相结合的透射电镜(tem)表征图，图d1和d2是沙门氏菌与沙门氏菌抗体修饰的铂钯纳米颗粒相结合的透射电镜(tem)表征图，进一步证明了铂钯纳米颗粒-抗体复合物的成功制备。

3、双通道试纸的组装

如图3所示，该试纸包括一个三角形样品垫、两个结合垫、两条硝酸纤维素膜(反应膜)、两个吸水垫和一张底板(也称背板)。样品垫的材料是硝酸纤维素膜，用1×pbs溶液(含有1％的bsa和0.25％的tween-20)浸泡，然后在室温下过夜干燥。其中一条硝酸纤维素膜喷涂兔源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体(作为检测线s)溶液(1.0mg/ml)和羊抗鼠igg抗体(作为质控线e)溶液(0.5mg/ml)。

其中另一条硝酸纤维素膜喷涂兔源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体(作为检测线s)溶液(1.0mg/ml)和羊抗鼠igg抗体(作为质控线e)溶液(0.5mg/ml)。

将结合垫分别喷涂上述方法制备的铂钯纳米颗粒-鼠源鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体复合物、铂钯纳米颗粒-鼠源大肠杆菌o157:h7单克隆抗体复合物。

然后在37℃下干燥过夜并在4℃下储存。

将样品垫、两个结合垫、两条硝酸纤维素膜(反应膜)和两个吸水垫依次组装在底板上，重叠约1-2mm。使用切纸机将单条试纸切割成宽度为4mm后，将具有不同检测线(s或e)的两条试纸组装在三角形样品垫上，组装的双通道试纸可以立即使用或在室温的干燥条件下储存。

实验例1实施例1制备的试纸的灵敏度测试

如图4a所示，当大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的浓度范围0到10⁸cfu/ml之间，双通道试纸在未加纳米酶的底物(tmb和h2o2)时，双通道试纸的灵敏度只有10⁶cfu/ml，并且图4b和图4c的峰面积响应曲线也说明同样的现象。当加入纳米酶的底物(tmb和h2o2)时，如图4d所示双通道试纸的灵敏度可以达到10cfu/ml，并且图4e和图4f的峰面积响应曲线也说明同样的现象。灵敏度的提高得益于以铂钯纳米颗粒代替传统的胶体金作为信号元件，以及以平行双通道设计代替单条多检测线设计减少了干扰。

实验例2实施例1制备的试纸的特异性测试

双通道试纸的特异性通过检测10⁶cfu/ml大肠杆菌o157:h7和10⁶cfu/ml鼠伤寒沙门氏菌的混合物、10⁶cfu/ml鼠伤寒沙门氏菌、10⁶cfu/ml大肠杆菌o157:h7、10⁸cfu/ml李斯特氏菌以及10⁸cfu/ml金黄色葡萄球菌。如图5所示，李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和pbs溶液菌没有明显的信号出现在双通道试纸的检测线上，证明特异性良好。

实验例3利用实施例1制备的试纸进行实际样品的检测

为了进一步验证该传感器的适用性，进行了加标回收实验。在2.5ml牛奶和冰淇淋中分别添加10⁴、10⁵cfuml^-1的大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌，混匀1min。然后利用该传感器技术对其中的大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌进行定量检测分析，结果显示(表1)回收率在91.44％至109.56％之间，证明该传感器能够用于现场检测。

表1人工污染牛奶和冰淇淋中沙门氏菌回收率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。