一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。
背景技术：
：鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)是一种革兰氏阴性菌，是引起急性胃肠炎的主要致病菌之一(cossua,levinre.rapidconventionalpcrandreal-time-qpcrdetectionoflownumbersoffromgroundbeefwithoutenrichment[j].foodbiotechnology,2014,28(2):96-105；torlake,akanim,inalm.evaluationofrapidchekselectforthescreeningofsalmonellainmeatandmeatproducts[j].journalofmicrobiologicalmethods,2012,90(3):217-219)。鼠伤寒沙门氏菌有广泛的宿主，几乎可以生存在一切活体组织上，很多家禽、家畜、鼠、鸟和冷血动物都是它们的自然宿主，蝇、蚤可带菌传播，常由污染的水、牛奶和食物在人和动物之间，人与人之间和动物与动物之间传播。当感染此致病菌时，病初常表现为腹泻、发热，严重时会引起胃肠炎、败血症和其它炎症等，甚至危及生命(宁毅.高特异性碳纳米生物传感器快速检测沙门氏菌的研究[d].湖南师范大学,2014)。由鼠伤寒沙门氏菌引发的疾病非常常见，分布较广，从而给食品安全带来巨大的威胁。因此，实现鼠伤寒沙门氏菌有效快速的检测变得十分重要。由于催化发卡自组装技术有很多优点，因而常用于分析检测中建立高灵敏度的分析方法。但是传统的发卡结构在正常情况下会自己打开发卡结构，即使没有引发链存在时也会形成发卡自组装，即非特定性自组装，这样就会造成背景信号过高，因此灵敏度的提高受到一定的限制。所以本申请在催化发卡自组装技术基础上，在发卡结构上引入错配碱基，以降低测定的背景信号，提高信噪比，从而进一步提高测定灵敏度；以磁珠为载体固定捕获dna，通过错配催化发卡自组装技术并通过羟胺-o-磺酸作为氧化剂催化lumaunps产生化学发光的方法，对鼠伤寒沙门氏菌进行了检测。方法具有灵敏度高、选择性好的特点。技术实现要素：本发明旨在发明一种方法简单、灵敏度高的测定鼠伤寒沙门氏菌的方法。鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。实现本发明目的技术方案是：一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子lumaunps，以探针dna修饰lumaunps，得化学发光探针；然后用发卡结构的捕获dna修饰磁珠得捕获dna修饰磁珠；以适体dna和适体互补序列dna修饰磁珠，得dna修饰磁珠；将含目标物鼠伤寒沙门氏菌溶液加入dna修饰磁珠溶液中，在dna修饰磁珠溶液中鼠伤寒沙门氏菌与适体特异性结合把适体互补序列dna释放到溶液中，磁分离后吸取清液加入到捕获dna修饰磁珠溶液中，适体互补序列dna与捕获dna修饰磁珠中的捕获dna发生杂交反应，使得捕获dna的发卡结构打开，在化学发光探针上的探针dna杂交作用下，通过催化发卡自组装技术将化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，再加入羟胺-o-磺酸，以lumaunps—羟胺-o-磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现鼠伤寒沙门氏菌的测定；lumaunps—羟胺-o-磺酸为化学发光体系，提高了检测信号强度；在探针dna中引入三个错配碱基降低了背景信号，提高了测定灵敏度。本发明是通过以下措施来实现的：一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征是包括以下步骤：(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备；(2)捕获dna修饰磁珠的制备；(3)探针dna修饰lumaunps的制备；(4)dna修饰磁珠的制备；(5)鼠伤寒沙门氏菌的检测；优选的，所述的鲁米诺胶体金纳米粒子的制备包括以下步骤：实验开始前，将所用的玻璃仪器用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干。取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01ml～5ml0.01m的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即lumaunps，将制得的lumaunps转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用。优选的，所述的捕获dna修饰磁珠的制备包括以下步骤：取10μl～100μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml离心管中，用10μl～200μl浓度为0.1m咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01ml～2ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μl～200μl浓度为5.0×10-8m捕获dna，在37℃条件下振荡过夜，得到捕获dna修饰磁珠，然后再用2.0ml0.1mpbs缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mlpbs缓冲溶液中，4℃保存。优选的，所述的探针dna修饰lumaunps的制备包括以下步骤：将1μl～20μl的tcep加到10μl～200μl浓度为1.0×10-6m的探针dna溶液中，37℃条件下振荡活化1小时，再取100μl～1000μl合成好的lumaunps加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μl～200μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mlph7.4的0.1mpbs缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得探针dna修饰lumaunps，即化学发光探针。最后得到的化学发光探针分散到1000μlph7.4的0.1mpbs缓冲溶液中，4℃保存备用。优选的，所述的dna修饰磁珠的制备包括以下步骤：取10μl～200μl羧基磁珠放入1.5ml离心管中，用10μl～200μlph7.0浓度为0.1m咪唑缓冲液洗三次，然后分散到1ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑缓冲液中，37℃条件下振荡反应30min；然后在离心管中同时加入10μl～500μl5.0×10-8m的鼠伤寒沙门氏菌适体和10μl～500μl5.0×10-8m的适体互补序列dna，37℃条件下振荡过夜，得到的dna修饰磁珠用2.0ml0.1mph7.4pbs清洗三次，最后分散到2.0mlpbs中，4℃保存。优选的，所述的鼠伤寒沙门氏菌的检测包括以下步骤：取10μl～200μldna修饰磁珠溶液置于离心管中，然后取10μl～100μl含鼠伤寒沙门氏菌的溶液加入到离心管中，37℃条件下震荡反应，通过鼠伤寒沙门氏菌与其适体的特异性结合把适体互补序列dna释放到溶液中，磁分离后吸取清液加入到10μl～100μl捕获dna修饰磁珠溶液中，同时加入10μl～100μl化学发光探针，37℃条件下震荡反应2h后，将磁珠用0.1mpbs缓冲液清洗三次，加入100μlnaoh，待基线稳定后，用注射器注入100μl3mm的羟胺-o-磺酸，开始记录化学发光强度，用峰值来衡量化学发光强度的大小，据此建立测定鼠伤寒沙门氏菌的含量。所述的dna序列为：捕获dna：5’-nh2-cccggtagttattcaaagatgagtctaccgggtttaatccactcatctttgaataa-3’；适体互补序列dna：5’-actcatctttgaataactaccggg-3’；适体dna:5’-nh2-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga-3’探针dna：5’-agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaattcgtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc-sh-3’。其中，探针dna的自5’端起第39、40和41三个碱基为错配碱基。本发明研究了不同浓度鼠伤寒沙门氏菌与化学发光强度之间的关系，得到了检测鼠伤寒沙门氏菌的标准曲线，线性范围及线性方程。发明的优点与效果当鼠伤寒沙门氏菌的浓度在500cfu/ml～15000cfu/ml之间时，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度的变化，化学发光强度有明显变化。经计算得到检测鼠伤寒沙门氏菌的线性方程为y＝0.0629x+388.772(y：化学发光强度；x：鼠伤寒沙门氏菌浓度，单位为cfu/ml)，线性相关系数为0.998，检出限为160cfu/ml(3σ)。(图2)。该测定方法的精密度通过对浓度为5000cfu/ml的鼠伤寒沙门氏菌进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为3.4％，表明本测定方法有较好的重现性。方法灵敏度高，这是归于探针dna中错配碱基的存在，当无目标物存在时，探针dna与捕获dna杂交效率极大的降低，从而降低背景信号；当探针dna中无错配碱基或错配碱基数目少时，当无目标物存在时，探针dna与捕获dna杂交效率得不到有效的减低，因而背景信号高。所以探针dna中存在错配碱基时，检出限低。附图说明图1检测鼠伤寒沙门氏菌的原理示意图。图2鼠伤寒沙门氏菌的浓度与化学发光强度关系图。图3方法的选择性。鼠伤寒沙门氏菌(a)、副溶血性弧菌(b)、单增李斯特菌(c)、金黄色葡萄球菌(d)和大肠杆菌(e)。图4催化发卡自组装技术与错配催化发卡自组装技术化学发光信号的比较。s代表样品信号，b代表背景信号。具体实施方式下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。实例1：一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法1.实验部分1.1仪器与试剂1.1.1仪器设备dhg鼓风干燥箱(善志仪器设备有限公司，上海)；ar224cn型奥豪斯分析天平(青岛中和恒信电子有限公司，青岛)；thz型恒温振荡箱(佳源兴业科技有限公司，北京)；rfl-1型超微弱化学发光检测仪(瑞迈分析仪器有限公司，西安)；anke-tgl-16c飞翁牌高速离心机(安亭科学仪器厂，上海)。1.1.2试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、氯金酸(haucl4)从sigma公司购买；粒径为0.5μm，浓度为10mg/ml的羧基磁珠从天津倍思乐色谱技术开发中心购买；鲁米诺(luminol)、羟胺-o-磺酸(hosa)和tcep(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)购买于aladdin公司；0.01m的鲁米诺用0.1mnaoh溶解，在棕色瓶中保存在4℃冰箱中；取1g氯金酸加100ml水配成1％的氯金酸溶液，用棕色瓶保存，使用前用二次蒸馏水稀释。pbs缓冲溶液是0.10m，ph7.4，其的配制方法是称取0.2gkh2po4、8.0gnacl、2.9gna2hpo4·12h2o及0.2gkcl溶解于2l水中，即得。所用到的dna由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：捕获dna：5’-nh2-cccggtagttattcaaagatgagtctaccgggtttaatccactcatctttgaataa-3’；适体互补序列dna：5’-actcatctttgaataactaccggg-3’；适体dna:5’-nh2-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga-3’探针dna：5’-agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaattcgtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc-sh-3’。发卡结构的dna进行孵育处理后再使用。1.2lumaunps的合成实验开始前，所用的玻璃仪器均用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干。取100μl1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成50ml0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在三口烧瓶中加磁子，并将其放入磁力搅拌器中，磁力搅拌下加热回流煮沸。待溶液沸腾后，快速加入1ml0.01m的鲁米诺溶液，继续加热煮沸40min，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热并在继续搅拌下冷却至室温。将制得的lumaunps转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用。1.3捕获dna修饰磁珠的制备取50μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml离心管中，用100μl浓度为0.1m咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到1ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后在离心管中加入100μl浓度为5.0×10-8m捕获dna，在37℃条件下振荡过夜，得到捕获dna修饰的磁珠，然后再用2.0ml0.1mpbs缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mlpbs缓冲溶液中，4℃保存。1.4探针dna修饰lumaunps的制备将5μl的tcep加到100μl浓度为1.0×10-6m的探针dna溶液中，37℃条件下振荡活化1小时，再取600μl合成好的lumaunps加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入50μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mlph7.4的0.1mpbs缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得探针dna修饰lumaunps，即化学发光探针。最后得到的化学发光探针分散到1000μlph7.4的0.1mpbs缓冲溶液中，4℃保存备用。1.5dna修饰磁珠的制备取100μl羧基磁珠放入1.5ml离心管中，用100μlph7.0浓度为0.1m咪唑缓冲液洗三次，然后分散到1ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑缓冲液中，37℃条件下振荡反应30min；然后在离心管中同时加入250μl5.0×10-8m的鼠伤寒沙门氏菌适体和100μl5.0×10-8m的适体互补序列dna，37℃条件下振荡过夜，得到的dna修饰磁珠用2.0ml0.1mph7.4pbs清洗三次，最后分散到2.0mlpbs中，4℃保存。1.6鼠伤寒沙门氏菌的检测取100μldna修饰磁珠溶液置于离心管中，然后取50μl含鼠伤寒沙门氏菌的溶液加入到离心管中，37℃条件下震荡反应，通过鼠伤寒沙门氏菌与其适体的特异性结合把适体互补序列dna释放到溶液中，磁分离后吸取上清液加入到50μl捕获dna修饰磁珠溶液中，同时加入50μl化学发光探针，37℃条件下震荡反应2h，通过适体互补序列dna与捕获dna的作用以及探针dna与适体互补序列dna和捕获dna的作用，化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，将磁性分离物分散在50μlph7.4的0.1mpbs缓冲溶液中，然后再加入羟胺-o-磺酸溶液，产生化学发光。根据标准溶液浓度和化学发光强度关系作图得标准曲线。1.7特异性评价为了检测该体系对鼠伤寒沙门氏菌的特异性，对不同的食源性致病菌做了分析。研究了鼠伤寒沙门氏菌(a)、副溶血性弧菌(b)、单增李斯特菌(c)、金黄色葡萄球菌(d)和大肠杆菌(e)对化学发光的响应，实验所用致病菌的浓度为2000cfu/ml，化学发光信号如图3所示，结果表明只有鼠伤寒沙门氏菌表现出较高的化学发光信号，证明本实验所建立的方法对鼠伤寒沙门氏菌具有特异性。实例2：方法的灵敏度比较利用非错配探针dna：5’-agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaataactaccgggtttaatcccacgagatactgttcc-sh-3’；一个错配碱基探针dna：5’-agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaataagtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc-sh-3’；两个错配碱基探针dna：5’-agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaatatgtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc-sh-3’代替探针dna，其他步骤相同，按本发明的方法对鼠伤寒沙门氏菌进行检测，测定的检出限分别为10000cfu/ml、4500cfu/ml和1980cfu/ml，均高于三个错配碱基探针dna时的检出限。表明本发明提出的一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法具有高的灵敏度。实例3：错配对体系的影响为了减弱背景信号、提高信噪比，探究了催化发卡自组装技术与本申请错配催化发卡自组装技术对实验的影响。在催化发卡自组装技术中，捕获dna采用如上所述序列，探针dna为非错配探针dna；本申请在探针dna的3’末端2区域dna序列错配三个碱基，即探针dna。如图4所示，在其他条件相同下，在没有鼠伤寒沙门氏菌存在时，采用非错配探针dna时，化学发光信号为373，而采用探针dna时，信号只有147。虽然在相同的情况下发卡自组装技术的信号高于错配催化发卡自组装技术的信号，但其信噪比为7.0，而错配催化发卡自组装技术的信噪比为13.9。综上所述，采用的错配催化发卡自组装技术有效地降低了背景信号，且提高了检测的灵敏度。实例4：样品分析将含鼠伤寒沙门氏菌的样品溶液按步骤1.6方法进行实验，根据化学发光强度和步骤1.6所得标准曲线可以获取鼠伤寒沙门氏菌含量。根据发明的方法对鼠伤寒沙门氏菌含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为98.7–102.8％，测定结果见表1，本发明的方法在鼠伤寒沙门氏菌检测中具有精密度高的特点。表1.样品分析测定结果编号含量a,b标准加入量测得量回收率10100098798.7％215621500301997.1％3250925005078102.8％a7次测定平均值b单位：cfu/ml。sequencelisting<110>青岛科技大学<120>一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>56<212>dna<213>人工序列<400>1cccggtagttattcaaagatgagtctaccgggtttaatccactcatctttgaataa56<210>2<211>24<212>dna<213>人工系列<400>2actcatctttgaataactaccggg24<210>3<211>40<212>dna<213>人工系列<400>3agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga40<210>4<211>72<212>dna<213>人工系列<400>4agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaattcgtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc72<210>5<211>72<212>dna<213>人工系列<400>5agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaataactaccgggtttaatcccacgagatactgttcc72<210>6<211>72<212>dna<213>人工系列<400>6agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaataagtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc72<210>7<211>24<212>dna<213>人工系列<400>7agatgagtggattaaacccggtagactcatctttgaatatgtaccgggtttaatcccacgagatactgttcc72当前第1页12