一种彩色荧光颗粒标记抗体的方法及使用其制备的试纸条与流程

本发明涉及一种彩色荧光颗粒标记抗体的方法及使用其制备的试纸条，此方法制备的试纸条可用于包括但不限于犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、猫白血病病毒、马立克氏病病毒，新城疫病毒等动物病毒的快速检测，属于医学检验领域。

背景技术：

与其他微生物相比，病毒在结构、化学组成、繁殖方式及对药物敏感性方面均有显著区别。动物病毒病具有传染性强、流行广泛、危害严重和发病率高的特点，因此如何快速诊断成了控制和治疗这些动物病毒病的关键因素。当前，各兽医实验室检测动物病毒病主要利用血清学试验和分子生物学试验，这些方法往往耗时较长，起不到快速检测的作用。

近年来，免疫层析方法日渐成熟，其具有耗时短、操作简便、成本低廉适用于现场大量样本快速测试等特点，已在动物病毒的检测领域取得了长足的发展。其中，胶体金因易制备、生物相容性好、颜色多变等优势成为了免疫层析分析法中最常用的标记原料。在动物病毒监检测中，胶体金因其鲜明的颜色可轻易实现定性检测，并且通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，可实现定量检测。但是，体金的生产成本相对较高，使用物理吸附使其对抗体和包被原等原料的要求比较高；当金颗粒过大时，标记物又不稳定导致批间差异大；且胶体金信号较弱，灵敏度低等限制了其应用。因此需要一种价格低廉的，易制备，稳定的，灵敏度高的标记颗粒替代胶体金用于动物病毒检测的免疫层析。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于提供了一种彩色荧光颗粒标记抗体的方法及使用其制备的试纸条实现动物病毒的快速检测，并解决胶体金成本高，信号弱，测试线显色不明显，定量检测批间差异大等问题。彩色荧光颗粒标记抗体的方法制备的试纸条，可同时实现高灵敏度的动物病毒的定性和定量检测。

本发明提供的彩色荧光颗粒标的抗体，以键合铕³⁺的彩色荧光乳胶微球为例的制备方法，包括以下步骤：

(1)将定量的彩色荧光乳胶微球溶液加到缓冲溶液中稀释，超声1.5min，得到彩色荧光微球分散液。

(2)向步骤(1)中的彩色荧光乳胶微球分散液中迅速滴入活化剂，快速置于涡旋振荡器上低速震荡1min后，固定在涡旋振荡器上，室温下震荡活化30min。

(3)活化结束后，将步骤(2)中的彩色荧光乳胶微球分散液在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，用步骤(1)中的缓冲溶液清洗，再次以相同条件离心后，弃去上清液，用步骤(4)中缓冲溶液复溶重悬。

(4)取相应动的物病毒的单克隆抗体，加入缓冲溶液稀释至0.085mg/ml。

(5)将步骤(3)中复溶的纳米颗粒分散液加入到步骤(4)中的抗体稀释液中，立刻在涡旋震荡器上震荡1.5min，随后超声1.5min，然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(6)反应结束后，将步骤(5)中溶液超声1min，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，加入封闭液，同样然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(7)将步骤(6)中溶液离心后再次加入封闭液清洗，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，可得到彩色荧光微球标记的抗体。

步骤(1)的缓冲溶液是2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液，其ph为7.2。

步骤(2)中活化剂是edc&nhs活化剂。

步骤(3)中复溶的缓冲溶液以及步骤(4)的缓冲溶液均是硼酸酸缓冲溶液，其ph值为7.8。

本发明还提供了一种基于上述方法制备的彩色荧光微球标记的抗体的试纸条，其特征在于，试剂盒的结构如图1所示：在塑料底板(1)一端粘贴样品垫(2)，样品垫的一端紧密压接喷涂有彩色荧光微球标记的动物病毒抗体的结合垫(3)，结合垫(3)一端紧密压接硝酸纤维素nc膜(4)，nc膜上包被有检测线t1(5)和质控线c(6)，nc膜的另一端连接吸水垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡壳内形成试纸卡。包括以下组装步骤：

(1)抗体标记的彩色荧光微球中加入重悬液，反复吹打，随后超声5min直至沉淀完全溶解。

(2)将步骤(1)中的抗体标记的彩色荧光微球溶液用划膜喷金机喷涂于结合垫，随后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)将对照线和检测线要包被的抗体，分别用适宜的稀释液稀释后，用划膜喷金机将其分别喷涂于硝酸纤维素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)组装粘贴结合垫、样品垫，密封过夜，使之充分粘合。

步骤(2)中彩色荧光微球标记的抗体溶液的溶度为1.5mg/ml，涂覆量为5μl/cm。

步骤(3)中硝酸纤维素膜的对照线包被的抗体为抗鼠lgg多克隆抗体，涂覆量为0.9μl/cm；检测线包被的抗体为动物病毒单克隆抗体，涂覆量为0.9μl/cm。

本发明提供了此动物病毒检测试纸条的使用方法：

(1)使用移液器，取定量体积的动物血清、血浆、全血样品加入到样品稀释液中，充分混合后，取定量体积的测试液加入到试纸条的加样槽中，等待3～6min中，若只有质控线出现彩色条带，表明测试结果为阴性，样品中不含相应的动物病毒；若对照线和测试线均显现出彩色条带，测试结果为阳性，继续等待至15min，使用配套荧光定量检测仪器检测，可定量给出样品中动物病毒的含量。

本发明提供了上述制备方法制备的试纸条在动物病毒检测中的应用。

相对于现有技术，本发明提出彩色荧光颗粒标记抗体的方法及使用其制备的试纸条，有以下优势：

(1)本发明所述的抗体标记的方法是利用彩色荧光微球表面的功能基团，采用化学共价键合的方式与抗体结合，使得抗体标记的彩色荧光微球比起胶体金更为稳定。

(2)本发明所述试纸用于动物病毒检测时，在3～6min内即可得到定性检测结果，随后在15min时使用配套的荧光定量检测仪器，即可定量得到准确的结果，实现了定性定量同时检测。

(3)本发明所述试纸用于动物病毒检测时，最低检测限可达到4ng/ml,灵敏度高于胶体金免疫层析法。

附图说明

本发明的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明中的示意实施例用于说明本发明，并不对本发明构成限定。

图1为本发明内容中彩色荧光微球标记的检测试纸条的结构示意图。

图2为本发明实施例一中的彩色荧光微球标记的犬瘟热病毒抗体制备的试纸条的测试结果。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

一种彩色荧光微球标记的犬瘟热病毒抗体制备的试纸条，包括以下步骤：

(1)将定量的彩色荧光乳胶微球溶液加到缓冲溶液中稀释，超声1.5min，得到彩色荧光微球分散液。

(2)向步骤(1)中的彩色荧光乳胶微球分散液中迅速滴入活化剂，快速置于涡旋振荡器上低速震荡1min后，固定在涡旋振荡器上，室温下震荡活化30min。

(3)活化结束后，将步骤(2)中的彩色荧光乳胶微球分散液在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，用步骤(1)中的缓冲溶液清洗，再次以相同条件离心后，弃去上清液，用步骤(4)中缓冲溶液复溶重悬。

(4)分别取犬瘟热病毒的单克隆抗体，分别加入缓冲溶液稀释至0.085mg/ml。

(5)将步骤(3)中复溶的纳米颗粒分散液加入到步骤(4)中的抗体稀释液中，立刻在涡旋震荡器上震荡1.5min，随后超声1.5min，然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(6)反应结束后，将步骤(5)中溶液超声1min，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，加入封闭液，同样然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(7)将步骤(6)中溶液离心后再次加入封闭液清洗，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，可得到彩色荧光微球标记的抗体。

步骤(1)的缓冲溶液是2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液，其ph为7.2。

步骤(2)中活化剂是edc&nhs活化剂。

步骤(3)中复溶的缓冲溶液以及步骤(4)的缓冲溶液均是硼酸酸缓冲溶液，其ph值为7.8。

本发明还提供了一种基于上述方法制备的彩色荧光微球标记的抗体的试纸条，包括以下组装步骤：

(1)抗体标记的彩色荧光微球中加入重悬液，反复吹打，随后超声5min直至沉淀完全溶解。

(2)将步骤(1)中的抗体标记的彩色荧光微球溶液用划膜喷金机喷涂于结合垫，随后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)将对照线和检测线要包被的抗体，分别用适宜的稀释液稀释后，用划膜喷金机将其分别喷涂于硝酸纤维素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)组装粘贴结合垫、样品垫，密封过夜，使之充分粘合,可得到犬瘟热和猫白血病病毒检测试纸卡。

步骤(2)中彩色荧光微球标记的抗体溶液的溶度为1.5mg/ml，涂覆量为5μl/cm。

步骤(3)中硝酸纤维素膜的对照线包被的抗体为抗鼠lgg多克隆抗体，涂覆量为0.9μl/cm；检测线包被的抗体为犬瘟热病毒单克隆抗体，涂覆量为0.9μl/cm。

本发明提供了此动物病毒检测试纸条的使用方法：

(1)使用移液器，取定量体积的犬血清、血浆、全血样品加入到样品稀释液中，充分混合后，取定量体积的测试液加入到试纸条的加样槽中，等待3～6min中，若只有质控线出现彩色条带，表明测试结果为阴性，样品中犬瘟热病毒；若对照线和测试线均显现出彩色条带，测试结果为阳性，继续等待至15min，使用配套荧光定量检测仪器检测，可定量给出样品中动物病毒的含量。

实验与验证结果

1.使用本案例彩色荧光微球标记的犬瘟热病毒抗体制备的试纸条进行犬瘟热病毒测试。如图2所示，阴性和阳性都进行量两组平行测试，两组测试均成功。加样后5min时，阴性样品检测结果只有对照线出现彩色线条，而阳性样品检测结果出现两条彩色线条，15min时使用配套荧光定量检测仪器检测，两组阳性定量结果分别为18.6ng/ml,19.1ng/ml。

实施例二

一种彩色荧光微球标记的猫白血病病毒抗体制备的试纸条，包括以下步骤：

(8)将定量的彩色荧光乳胶微球溶液加到缓冲溶液中稀释，超声1.5min，得到彩色荧光微球分散液。

(9)向步骤(1)中的彩色荧光乳胶微球分散液中迅速滴入活化剂，快速置于涡旋振荡器上低速震荡1min后，固定在涡旋振荡器上，室温下震荡活化30min。

(10)活化结束后，将步骤(2)中的彩色荧光乳胶微球分散液在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，用步骤(1)中的缓冲溶液清洗，再次以相同条件离心后，弃去上清液，用步骤(4)中缓冲溶液复溶重悬。

(11)分别取猫白血病病毒的单克隆抗体，分别加入缓冲溶液稀释至0.085mg/ml。

(12)将步骤(3)中复溶的纳米颗粒分散液加入到步骤(4)中的抗体稀释液中，立刻在涡旋震荡器上震荡1.5min，随后超声1.5min，然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(13)反应结束后，将步骤(5)中溶液超声1min，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，加入封闭液，同样然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(14)将步骤(6)中溶液离心后再次加入封闭液清洗，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，可得到彩色荧光微球标记的抗体。

步骤(1)的缓冲溶液是2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液，其ph为7.2。

步骤(2)中活化剂是edc&nhs活化剂。

步骤(3)中复溶的缓冲溶液以及步骤(4)的缓冲溶液均是硼酸酸缓冲溶液，其ph值为7.8。

本发明还提供了一种基于上述方法制备的彩色荧光微球标记的抗体的试纸条，包括以下组装步骤：

(5)抗体标记的彩色荧光微球中加入重悬液，反复吹打，随后超声5min直至沉淀完全溶解。

(6)将步骤(1)中的抗体标记的彩色荧光微球溶液用划膜喷金机喷涂于结合垫，随后在烘箱中37℃下烘干1h。

(7)将对照线和检测线要包被的抗体，分别用适宜的稀释液稀释后，用划膜喷金机将其分别喷涂于硝酸纤维素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(8)组装粘贴结合垫、样品垫，密封过夜，使之充分粘合,可得到犬瘟热和猫白血病病毒检测试纸卡。

步骤(2)中彩色荧光微球标记的抗体溶液的溶度为1.5mg/ml，涂覆量为5μl/cm。

步骤(3)中硝酸纤维素膜的对照线包被的抗体为抗鼠lgg多克隆抗体，涂覆量为0.9μl/cm；检测线包被的抗体为猫白血病病毒单克隆抗体，涂覆量为0.9μl/cm。

本发明提供了此猫白血病病毒检测试纸条的使用方法：

(1)使用移液器，取定量体积的猫血清、血浆、全血样品加入到样品稀释液中，充分混合后，取定量体积的测试液加入到试纸条的加样槽中，等待3～6min中，若只有质控线出现彩色条带，表明测试结果为阴性，样品中猫白血病病毒；若对照线和测试线均显现出彩色条带，测试结果为阳性，继续等待至15min，使用配套荧光定量检测仪器检测，可定量给出样品中

动物病毒的含量。

实验与验证结果

1.使用本案例彩色荧光微球标记的猫白血病病毒抗体制备的试纸条还以猫白血病病毒为例测定50份临床样本，区间判定结果和样本值的符合率为94.2％。本发明、所述的彩色荧光微球标记的猫白血病病毒抗体制备的试纸条可以灵敏地定量检测样品中的猫白血病病毒。

2.使用本案例彩色荧光微球标记动物病毒抗体制备的试纸条的稳定性验证：组装后的试纸条，分别在两周、四周、八周后取出，取同样的测试样品检测，检测结果cv％较低，表明此试纸条具有良好的稳定性。