基于FRET辨别DNA碱基长度及检测单链DNA结合蛋白的生物传感方法与流程

本发明涉及荧光生物传感器，一种基于荧光共振能量转移(fret)辨别dna碱基长度并检测单链dna结合蛋白(ssb)的荧光传感方法。

背景技术：

dna是生命的物质基础，编码着自然界千变万化的遗传现象，贮存着生物界无穷无尽的遗传信息。众所周知，dna分子由a、t、c、g四种核苷酸经3’，5’-磷酸二酯键相连构成dna的基本骨架，并组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。其中包含的指令，与病原基因和遗传疾病、基因表达调控、细胞增殖分化和调亡及癌症的发生、发展存在着重要的联系。如果它在结构上稍有所改变、缺失或增多，就可能会引起遗传信息的改变或各种疾病的出现。目前，简单的静电作用不能容易地区分单链dna、双链dna或是dna的长度。因此，发明一种无标记、容易区分单链dna、双链dna或是dna长度的分析传感方法对相关疾病的预前预后检测具有十分重要的意义。

蛋白和dna之间的作用在很多生物过程中起着非常重要的作用，例如：dna的复制、转录、重组以及修复等生命活动。单链dna结合蛋白(single-strandeddnabindingprotein，ssb)是所有活细胞中一种很关键的蛋白，能够与大量的蛋白发生作用，引导其他蛋白在dna复制、修复等过程中发挥作用。ssb是化学或酶降解过程中重要的蛋白类，能够保护单链dna(single-strandeddna，ssdna)。ssb可与ssdna结合，在dna的新陈代谢过程起到保护ssdna的作用，使ssdna在细胞中短暂地稳定存在。而在自然界存在许多不同类型的ssb，大肠杆菌中的ssb是比较典型的一种，单体的分子量大约为19kda，通常以四聚体的形式存在。ssb包含两个功能性结构域，分别是：位于n端的结合ssdna的寡核苷酸/寡聚糖结合结构域和位于c端的结构域。n端结构域与碱基堆积的共同作用下可与ssdna的磷酸骨架结合；而c末端含有一条由6个高度保守的氨基酸残基组成的富含天冬氨酸的无序结构域，具有结合dna复制、同源重组和损伤修复有关蛋白的能力。它能够与各种形式的ssdna结合，对ssdna的碱基序列没有特殊要求，可稳定折叠ssdna构象，但不能与双链dna发生作用。ssb与ssdna的结合是通过四个亚基与ssdna缠绕，紧密结合在一起。

目前，对ssb的研究只限于其与dna的结合方式，而用于检测ssb的方法却很少，主要有电化学发光法(ecl)、电化学法等；尽管以上方法各有优点，但仍存在一些不足之处，如：电化学发光测试方式复杂；电化学方法的稳定性不好、重复性差等。因此，开发一种灵敏、简便、快速的新型分析技术，实现对低浓度ssb的检测，是迫切需求的。

荧光法具有灵敏度高、动态范围广、操作简单等优点，具有很大的发展潜力，在分析传感器方面得到广泛的应用，目前应用荧光法检测ssb的报道较少，具有较大的发展空间。

铱配合物具有发光效率高、较大的stokes位移、发光颜色可以通过改变配体结构进行调节以及良好的光稳定性等优点而成为研究的热点。根据报道，铱配合物在生物传感器方面的应用越来越广泛。阳离子共轭聚合物(ccp)作为一种新型的水溶性荧光分子，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点。同时，共轭聚合物具有分子导线的功能，能够实现荧光信号的放大。目前基于铱配合物和ccp荧光共振能量转移(fret)现象检测ssb的荧光传感器尚未见报道。

本发明依据fret的原理，构建一种简单、高灵敏、快速的分析传感方法，用于辨别dna碱基长度并定量检测ssb。该传感器特异性好、灵敏度高、结果准确、快速，且过程及其简单，为临床应用提供了一种很有前景的检测手段。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠的基于fret的辨别dna碱基长度并检测ssb的荧光传感方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于fret辨别dna碱基长度并检测ssb的生物传感方法，具体步骤如下：

(1)将85～95μl浓度为3～4μmccp与0.5～2μl浓度为0.5～2mm铱配合物混合，然后加入0.05～0.15mph6.8～7.6的pbs缓冲溶液，得到用于检测ssb的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)。

(2)a.加入1～3μl5～15μm的单链dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)；通过更换不同碱基数量的单链dna，利用该方法辨别不同长度的dna；b.加入1～3μl5～15μm的发卡dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)。

注：a部分的实验步骤用于不同碱基数量dna的检测；b部分的实验步骤用于ssb的检测。

(3)不同浓度的ssb加入到步骤(2)中，然后加入缓冲溶液，30～40℃下温育5～15min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)，获得一系列不同浓度的ssb对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与ssb浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中ssb的未知浓度。

利用上述基于铱配合物和ccp的荧光生物传感器辨别dna碱基长度及检测ssb的方法，荧光扫描在400～700nm范围内，激发波长是380nm，狭缝宽度为10nm，扫描电压是700v，检测荧光强度比值i530/i415(即荧光共振能量转移效率)对不同浓度的单链dna或是ssb的响应，获得一系列不同浓度的单链dna或是ssb对应的i530/i415大小，建立i530/i415与单链dna或ssb浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，进行dna碱基长度的辨别，并确定待测样品中ssb的含量。

发明原理：本发明基于ccp和铱配合物良好的光谱重叠，设计了一种简单的、无标记的辨别dna碱基长度及检测单链dna结合蛋白的分析传感方法。体系中加入单链dna或发卡dna后，形成ccp/dna/铱配合物复合物，对体系的fret产生影响，fret效率急剧减小。当加入ssb之后，ssb将会和单链dna或是发卡dna呈单链dna状的环状部位结合，从而使ccp/dna/铱配合物复合物的量减少，从而使得体系中的ccp和铱配合物重新发生fret，i530/i415增大。基于以上机理，提出基于fret辨别dna碱基长度或是ssb检测的分析传感方法。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了一种基于fret辨别dna碱基长度及检测ssb的荧光生物传感器。首先，利用单链dna或发卡dna，形成ccp/dna/铱配合物复合物，拉大了ccp与铱配合物之间的距离，影响体系的fret。其次，加入ssb与dna结合，使ccp/dna/铱配合物复合物的量减少，成功制备传感器，fret恢复。实验结果表明，i530/i415的大小与dna碱基的长度相关，并与ssb浓度在一定范围内呈线性关系，成功辨别dna碱基长度并实现ssb的检测。其优点在于：

(1)高灵敏度。a.实验得出随着单链dna碱基数量的增加，i530/i415值越来越大，并和ssb的浓度呈现良好的线性关系，实现dna碱基长度的辨别；b.利用发卡dna实现单链dna结合蛋白的检测，得出传感器的i530/i415值与ssb浓度(c)的对数之间良好的线性关系，线性方程为i530/i415＝0.80+0.25×1gc(nm)，线性相关系数r²＝0.9966，表示曲线具有很好的拟合度，检测限为6.9pm。这些结果表明，我们构建的传感器对ssb的检测具有较低检测限和较高灵敏度。

(2)高特异性。将凝血酶(tb)、溶菌酶(lzm)、乙酰胆碱酯酶(ache)、牛血清蛋白(bsa)作为对照物质，浓度均为50nm，检测均无干扰。

(3)结果准确。在体积比为10％尿液和10％血清环境中，回收率均在90％～110％之间。

(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对ssb的高灵敏检测。

综上所述，本发明是基于fret构建的荧光生物传感器，用于辨别dna碱基长度及ssb检测，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现dna碱基长度的辨别及低浓度ssb的检测，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明传感器的可行性实验图；

图2位本发明传感器辨别dna碱基长度的荧光响应校准曲线图；

图3为本发明传感器对不同浓度ssb的荧光响应图；

图4为本发明传感器对不同浓度ssb的荧光响应校准曲线图；

图5为本发明传感器对ssb的选择性实验图；

图6为本发明传感器对ssb的抗干扰实验图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

实施例1

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于荧光共振能量转移(fret)辨别dna碱基长度并检测单链dna结合蛋白(ssb)的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将90μl浓度为3.28μmccp与1μl浓度为1mm铱配合物混合，然后加入0.1mph7.4的pbs缓冲溶液，得到用于检测ssb的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415。

(2)a.加入2μl10μm不同长度的单链dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值；b.加入2μl10μm的发卡dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415。

注：a部分的实验步骤用于不同碱基数量dna的检测；b部分的实验步骤用于ssb的检测。

(3)不同浓度的ssb加入到步骤(2)中，然后加入缓冲溶液，37℃下温育10min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)，获得一系列不同浓度的ssb对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与ssb浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以辨别体系中dna碱基长度并检测样品中ssb的未知浓度。

实施例2

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于荧光共振能量转移(fret)辨别dna碱基长度并检测单链dna结合蛋白(ssb)的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将87μl浓度为3.5μmccp与0.8μl浓度为1.2mm铱配合物混合，然后加入0.12mph7.2的pbs缓冲溶液，得到用于检测ssb的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415。

(2)a.加入1.5μl15μm的不同长度的dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415；b.加入1.5μl15μm的发卡dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415。

注：a部分的实验步骤用于不同碱基数量dna的检测；b部分的实验步骤用于ssb的检测。

(3)不同浓度的ssb加入到步骤(2)中，然后加入缓冲溶液，35℃下温育12min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)，获得一系列不同浓度的ssb对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与ssb浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以辨别体系中dna碱基长度并检测样品中ssb的未知浓度。

实施例3

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于荧光共振能量转移(fret)辨别dna碱基长度并检测单链dna结合蛋白(ssb)的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将92μl浓度为3.2μmccp与1.2μl浓度为0.9mm铱配合物混合，然后加入0.09mph6.9的pbs缓冲溶液，得到用于检测ssb的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415。

(2)a.加入3μl18μm的不同长度的dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415；b.加入3μl18μm的发卡dna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415。

注：a部分的实验步骤用于不同碱基数量dna的检测；b部分的实验步骤用于ssb的检测。

(3)不同浓度的ssb加入到步骤(2)中，然后加入缓冲溶液，30℃下温育15min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530/i415)，获得一系列不同浓度的ssb对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与ssb浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以辨别体系中dna碱基长度并检测样品中ssb的未知浓度。

二、可行性实验

具体实施示例1，先测定ccp/铱配合物体系的荧光强度，再加入dna组成ccp/dna/铱配合物体系，测定其荧光强度，然后加入ssb，测定体系的荧光强度。如图1，当体系中存在ccp和铱配合物时发生高效的fret；加入dna后，对体系的fret产生影响，fret效率急剧减小；加入ssb，dna会和ssb结合，形成ssb-dna复合物，从而使得体系中的ccp和铱配合物重新发生fret。

三、ssb检测应用

1、利用上述具体实施例1制备的荧光生物传感器辨别dna碱基长度及检测ssb的方法

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，检测ccp/dna/铱配合物体系中ccp(415nm)的荧光强度(i415)与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415对不同浓度ssb的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中dna碱基长度及ssb含量(具体实施示例1)。如图2所示，在530nm处，荧光强度比值随ssb浓度的增加而增强，呈现良好的线性关系，且随着单链dna碱基数量的增加，斜率越来越大，实现dna碱基长度的灵敏辨别；如图3所示，加入发卡dna，在530nm处，荧光强度比值随ssb浓度的增加而增强，实现ssb检测。

2、灵敏度试验

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，上述具体实施例1制备的ccp/发卡dna/铱配合物体系的荧光强度比值i530/i415，ssb浓度的范围为0～100nm，上述具体实施例1。试验结果说明，如图4所示，说明随着ssb浓度的增大，i530/i415越明显；传感器i530/i415对ssb浓度的对数的线性相关方程为i530/i415＝0.80+0.25×1gc(nm)，r²＝0.9966，线性范围为0.01～100nm，根据s/n＝3计算得知，检测限为6.9pm。说明传感器对ssb可实现高敏检测。

3、特异性实验

选择凝血酶(tb)、溶菌酶(lzm)、乙酰胆碱酯酶(ache)、牛血清蛋白(bsa)作为对照物质，浓度均为50nm。实验结果表明，对照物与空白相近，ssb对传感器的影响明显高于其他几种生物分子，该传感器用发卡dna检测ssb有良好的选择性。

(1)选择性实验

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，上述具体实施例1制备的ccp/发卡dna/铱配合物体系分别检测浓度为50nm的凝血酶(tb)、溶菌酶(lzm)、乙酰胆碱酯酶(ache)、牛血清蛋白(bsa)作为对照物质，每种对照物质的浓度均为50nm，检测结果如图5所示。实验结果表明，对照物与空白相近，ssb对传感器的影响明显高于其他几种生物分子，该传感器用发卡dna检测ssb有良好的选择性。

(2)抗干扰实验

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，上述具体实施例1制备的ccp/发卡dna/铱配合物体系在50nmssb存在下分别检测浓度为50nm的凝血酶(tb)、溶菌酶(lzm)、乙酰胆碱酯酶(ache)、牛血清蛋白(bsa)，每种对照物质的浓度均为50nm，检测结果如图6所示，观察到i530/i415的大小与仅有ssb存在时的i530/i415基本没有差异，说明传感器实现了对ssb的特异性检测。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。