一种ppt级Hg2+的安培分析方法与流程

本发明涉及一种ppt级hg²⁺的安培分析方法，具体是涉及一种基于t-hg²⁺-t相互作用和酶促沉积金属放大信号的ppt级hg²⁺的安培分析方法。

背景技术：

汞是最毒的重金属元素之一，可以引起各个年龄阶段的人的多种健康问题，如脑伤害、肾衰竭以及不同程度的认知和运动障碍[ariya,p.a.;amyot,m.;dastoor,a.;deeds,d.;feinberg,a.;kos,g.;poulain,a.;ryjkov,a.;semeniuk,k.;subir,m.;toyota,k.chem.rev.2015,115,3760]。世界卫生组织（who）和美国环境保护署（epa）分别规定饮用水中汞的含量不能超过1μg/l(1ppb)和2μg/l(2ppb)[aragay,g.;pons,j.;merkocci,a.chem.rev.2011,111,3433]。依照《地表水环境质量标准》（gb3838-2002）中规定，i类水中汞含量不能超过50ppt。所以，开发新型高效且灵敏的检测ppt级hg2+的方法很有必要。

katz首次发现胸腺嘧啶（t）可以与hg²⁺相互作用后[katz,s.j.am.chem.soc.1952,74,2238]，许多研究工作者利用t-hg²⁺-t复合物来制备电化学、比色或者荧光传感用于检测hg²⁺。酶催化金属沉积放大电化学信号在生化分析领域有广泛应用。lai和其团队发展了一种基于alp标记抗体并催化银沉积用于信号放大的多通路免疫传感，实现了higg和migg的同时检测[lai,g.s.;yan,f.;wu,j.;leng,c.;ju,h.x.anal.chem.2011,83,2726]。wang等报道了一种利用alp催化沉积银放大信号的三明治型的分析方法用于检测血液中的小分子rna[si,y.m.;sun,z.z.;qi,w.;li,s.y.;chen,l.j.;wang,h.anal.chem.2014,86,10406]。尽管有很多关于利用酶催化金属沉积用于信号放大的研究，但是没有发现利用这种方法进行电化学检测重金属离子的报道。另外，现有常见的直接检测可溶性酶促产物的方法存在扩散效应，会有检测下限不低、灵敏度低的弊端。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种ppt级hg²⁺的安培分析方法，该方法可以最大限度的放大检测信号，实现目标检测物hg²⁺的超敏检测，且条件温和，操作方便。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种ppt级hg²⁺的安培分析方法，包括以下步骤：

（1）以酶标记的dna电极为工作电极，在工作电极上以酶（即标记分子）为中心，进行酶促沉积金属的反应：在酶标记的dna电极上加入酶促反应液，反应完成后得到富含金属单质的电极表面；

所述酶促反应液包括酶底物和对应的金属盐溶液或氯金酸溶液；

本步骤中，通过酶催化酶底物所得的产物和金属盐溶液或氯金酸溶液发生氧化还原反应，生成金属单质沉积在酶附近；可显著降低目标物的检测下限；

（2）将步骤（1）所得富含金属单质的电极表面用于hg²⁺的电化学分析，用原位阳极溶出伏安法获得该工作电极上所富集的金属的溶出伏安信号，从而间接实现样品中hg²⁺的定量分析，使得电化学方法可以检测ppt级的hg²⁺。

进一步，步骤（1）中，所述酶为能催化底物产生具有还原性物质的酶，如葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酯酶等。所述酶底物的体积为1μl~10ml（浓度不同则体积不同）。

进一步，步骤（1）中，酶底物的浓度为1μmol/l稀溶液~饱和溶液。

进一步，步骤（1）中，酶底物为所用酶对应的底物。

进一步，步骤（1）中，所述金属盐溶液为能与酶促产物发生氧化还原生成金属单质的金属盐溶液；所述金属盐溶液浓度为1μmol/l稀溶液~饱和溶液。

进一步，步骤（1）中，所述金属盐溶液的体积为1μl~10ml（浓度不同则体积不同）。

进一步，步骤（1）中，所述金属盐为氯金酸钾、氯金酸钠、亚硫酸金钠、亚硫酸金钾或硝酸银。

进一步，步骤（1）中，所述酶标记的dna电极制备步骤为：通过t-hg²⁺-t配位，标记了生物素的信号探针与捕获探针结合，形成复合物；标记了酶分子的亲和素，再通过生物素-亲和素间的作用，使酶分子与所得复合物结合，制得酶标记的dna电极。

进一步，步骤（2）中，空气中预先施加能够实现酶促沉积金属的离子态电沉积的阴极电位（参见cn103472123b）为足够实现扩散控制的金属电沉积的阴极电位；所述足够实现扩散控制的金属电沉积的阴极电位为1.0v（vs.sce）~-0.2v（vs.sce）；“vvs.sce”意为相对于饱和甘汞电极的电位（伏特）。

进一步，步骤（2）中，使用阳极溶出伏安法对金属离子进行定量分析时，采用两电极或三电极体系。

本发明是对重金属离子hg²⁺进行定量分析，并且是在ppt级检测目标分析物的电化学分析方法，检测灵敏度高、成本低、简便、适于野外现场分析等；通过与金属盐发生氧化还原反应捕获酶促产物，并通过原位阳极溶出可以有效放大检测信号，可实现hg²⁺的ppt级检测。

附图说明

图1（a）和图1（b）为本发明实施例方法的实验步骤示意图；

图中：

图2（a）为实施例中本发明方法在酶促金属沉积后定量分析hg²⁺的电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图；

图2（b）为实施例中本发明方法在酶促金属沉积后定量分析hg²⁺的电极上检测得到的标准曲线图；

图2（c）为对比例方法中，直接通过t-hg²⁺-t配位定量分析hg²⁺的电极上、采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图；

图2（d）为对比例方法中，直接通过t-hg²⁺-t配位定量分析hg²⁺的电极上检测得到的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

参考例

以下为实施例使用的修饰电极（即酶标记的dna电极）的制备方法：

玻碳电极（gce）先后在0.5微米（μm）和0.05μm的氧化铝悬浊液中打磨抛光处理，再用超纯水冲洗电极表面（将电极表面的氧化铝粉末冲洗干净），接下来分别在超纯水、乙醇、超纯水中各超声5min以除去电极表面残留的氧化铝粉末；然后，在电极表面滴加浓h2so4（18.4mol/l）洗液并保持15s，用超纯水冲洗；最后用电化学清洗以彻底除去电极表面的污染物；电化学清洗步骤为：在10ml0.5mol/lh2so4中以-1.0v到1.0v以0.1v/s的扫速循环伏安扫描至稳定；处理好的玻碳电极用超纯水冲洗（将电极表面残留的h2so4冲洗干净）。然后用氮气吹干用于电沉积auplate。

通过双电位阶跃法将auplate沉积到处理好的玻碳电极上，即在含有2.0mmol/lhaucl4的0.50mol/lh2so4中，从1.1v至0v脉冲电镀180s（auplate/gce）即可；将电极洗净，氮气吹干，滴上10μl含1.0μmol/l巯基化的捕获探针（p1）和1.0mol/lnacl的tris–hno3缓冲液（ph7.4），湿润环境下室温吸附2h以达到饱和(p1/auplate/gce)；缓冲液洗掉多余的p1，用1mmol/l6-巯基己醇（mch）暗处理30min以封闭非特异性吸附位点(mch/p1/auplate/gce)；tris–hno3缓冲液洗后，mch/p1/auplate/gce在不用的时候4℃在tris–hno3缓冲液中保存。

将制备好的mch/p1/auplate/gce修饰电极在含1.0μmol/l生物素化的信号探针（p2）和不同浓度的hg²⁺hepes缓冲液中37℃孵育40min，形成p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce；

tris–hno3缓冲液清洗后，在电极上滴6μl含1wt%牛血清白蛋白（bsa）的tris–hno3缓冲液以封闭非特异性酶吸附位点，孵育10min(bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce)；tris–hno3缓冲液清洗掉多余的bsa后，电极再滴10μl0.03mg/ml碱性磷酸酯酶标记的亲和素（strep-alp），室温下反应35min，得到酶标记的dna电极（strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce）；未使用时，电极保存在4℃的hepes缓冲液中。

实施例：hg²⁺的电分析

本实施例为对重金属离子hg²⁺进行定量分析的方法，比较本发明与常规方法的分析性能。

本实施例包括以下步骤：

（1）本发明方法：在制备好的strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce电极上进行酶促金属沉积反应，简单来说就是在上述制备的电极上滴加10μl含1mmol/lagno3,1.5mmol/l抗坏血酸磷酸二酯钠（sap）和4mmol/lnh3·h2o（加入nh3·h2o防止agno3和sap形成不溶物）的酶促反应液，37℃下暗反应20min，得到富含金属银单质的电极表面（ag/strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce）；最终得到的电极用超纯水洗三次，使用之前自然烘干。

对比例：在参考例中制备的p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce电极上直接检测汞的信号。

（2）检测方法：参照中国发明专利“基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法”（参见cn103472123b），①在三电极系统中（工作电极为上述实施例中的修饰电极），空气中接上电化学仪器并预先施加能够充分实现酶促沉积的金属ag离子（或能够实现通过t-hg²⁺-t配位捕获的hg²⁺）电沉积的阴极电位-0.3v（vs.sce），再将10μl2mol/lhno3加至电极表面并导通电解池，使金属沉积物溶解为ag⁺，并同时将ag⁺电还原成原子态金属ag，从而在电极表面富集上金属银（或富集hg）。②直接在原工作电极表面，使用差分脉冲阳极溶出伏安法（dpv）检测金属银阳极溶出为银离子的信号，检测条件为：-0.3v(vs.sce（饱和甘汞电极）)沉积10min，扫描区间为-0.3~0.7v（或直接检测hg²⁺的信号，扫描区间为-0.3~0.4v），获得该工作电极上所富集到的金属银的阳极溶出电流信号，从而间接实现样品中目标分析物hg²⁺的定量分析（或直接实现hg²⁺的定量分析）。

测定结果分析：结合图2进行讨论，图2给出了两种方法中对不同浓度hg²⁺的信号响应，图2（a）为实施例中本发明方法在酶促金属沉积后得到的ag/strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图；图2（b）为实施例中本发明方法在酶促金属沉积后得到的hg²⁺检测标准曲线图；图2（c）为对比例中在通过t-hg²⁺-t配位得到的p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图；图2（d）为对比例中在通过t-hg²⁺-t配位得到的hg²⁺检测标准曲线图。从图中可知，随着hg²⁺浓度增加，电流响应也随之增加；本发明方法的响应信号明显大于对比例方法；本发明中银的氧化电流响应与hg²⁺浓度线性范围为0.1nmol/l~250μmol/l，检测下限为0.01nmol/l（2ppt）（信噪比为3），对比例方法是通过t-hg²⁺-t配位捕获hg²⁺直接测汞的氧化电流，线性范围为2.5μmol/l~1mmol/l，检测下限为0.5μmol/l（100ppb）；本发明方法线性范围宽，检测下限低，参照国家发明专利“基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法”（专利号：201310459224.4）的电化学检测方法使得检测下限达到了ppt级水平。

综上所述，本发明涉及的分析方法灵敏度高、操作简便、通用性好，与“基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法”发明专利（专利号：201310459224.4）方法的联用，实现了酶促金属沉积用于ppt级hg²⁺的电化学检测，并且在实际样品中的检测结果令人满意，具有进一步开发的潜力。