一种硅藻UPA基因分析方法及其在法医检测中的应用与流程

本发明涉及法医学领域，具体涉及一种硅藻upa基因的分析方法及其在法医检测中的应用。

背景技术：

在法医学检案实践中，时常遇到溺死相关案件的检验鉴定。由于我国江河湖海众多，环境复杂，以及尸体腐败等因素影响，水中尸体的死因鉴定一直是法医学实践中的难点之一。对于如何判断水中尸体是生前入水或死后抛尸入水，学界仍存在争议。硅藻检验一直是法医学实践中最常用的方法。目前硅藻检验的方法有很多，但国内常用的硅藻检验法主要基于硅藻形态学进行检测。然而随着分子生物学技术的发展，已有学者尝试通过pcr检测硅藻特异性的dna条形码进行溺死的死因鉴定。dna条形码是指利用短的标准dna序列的核苷酸多样性进行物种的鉴定，利用dna条形码进行硅藻检验可以避免形态学难以区分的藻类，消除人工观察和计数的实验误差。

与传统的硅藻形态学检验方法相比，荧光定量pcr扩增检测硅藻dna条形码用于溺死鉴定主要有以下优点：①检测特异性强，可用于不能用显微镜进行形态辨别的硅藻检验；②灵敏度高，所需样本量明显小于传统硅藻检验法；③可用于推断溺死地点和时间。利用硅藻dna条形码的特异性，可以在定性的同时揭示群落特征，如进一步建立不同水域和同一水域不同时间硅藻生物群落特征变化监控系统，并与传统硅藻检验法相结合，对溺死鉴定则有更重要的实用价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术中的缺陷和不足，提供了一种对硅藻upa基因（universalplastidamplicon），通用质体扩增区)的分析方法，以及利用对硅藻upa基因的分析方法在法医检测中的应用，具体是在判断溺亡者真实死因上的应用。

upa基因,该片段是叶绿体23srrna基因的v结构域，长度约370bp。upa基因的测序效率和扩增效率都很高，并具有较高的分辨率，适合硅藻分子分类研究。硅藻是一种广泛分布于水中的单细胞生物，细胞壁由大量硅物质组成，硅藻的种内繁多，形态各异，每一处水源的硅藻组成都不尽相同。因此，通过检测水中尸体各主要脏器内硅藻的存在不仅可成为判断是否生前溺死的重要证据之一，亦可对判断死亡地点具有重要意义。目前利用硅藻检验判定溺死的标准是肺脏，肝脏，肾脏等组织内发现硅藻，且硅藻种类与现场水样一致即可诊断为溺死。

本发明所要达到的技术效果通过以下方案实现：

本发明中提供一种硅藻upa基因在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。

本发明中提供一对检测硅藻upa基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如seqidno.1所示，下游引物的序列如seqidno.2所示。

本发明中还提供一种硅藻upa基因的分析方法，提取硅藻内核酸，利用权利要求2所述引物对上述核酸中upa基因进行扩增，利用扩增产物制备待测样本，对待测样本进行核酸分析。进一步地，所使用的探针为5’-cggaggcgtacaaag-3’，且探针5’端以fam荧光报告基团标记，3’端以nfq-mgb荧光淬灭基团标记。

本发明中还提供一种硅藻upa基因的荧光定量pcr扩增检测分析方法，具体为：扩增检测反应体系为20ml：premixextaq试剂10ml，浓度为10μmol/l的正向引物0.4ml，浓度为10μmol/l的反向引物0.4ml，roxreferencedyeii0.2ml，探针0.8ml，dna模板2ml，灭菌双蒸水6.2ml。对于特异性验证试验，dna模板指的是硅藻的基因组dna，对于案件检测实验，dna模板指的是检材基因组总dna。这两者的基因组dna皆含有硅藻upa基因。

进一步地，pcr反应条件为：stage1：预变性95℃，30s，升温速率20℃/s，1cycle；stage2：pcr反应95℃，5s，升温速率20℃/s，60℃，34s，升温速率20℃/s，40cycles；在退火步骤进行荧光信号收集。

待测样本的制备方法为：取死者实体脏器，使用核酸提取试剂盒提取脏器中的基因组dna进行荧光定量pcr扩增检测，使用核酸提取试剂盒提取脏器中的基因组dna即为待测样本。

本发明中还提供一种上述硅藻upa基因荧光定量pcr检测分析方法在法医检测过程中的应用，具体是应用于判断溺亡者是否真正死于溺亡。

进一步地，所述的应用方法为：取溺水者脏器组织，提取该脏器组织中的核酸，使用如权利要求2所述的引物对进行荧光定量pcr扩增检测分析，确认待测样本是否含有硅藻upa基因，根据硅藻upa基因的检出与否判断溺亡者是否真正为溺亡。

本发明还提供一种判断溺亡者是否真正死于溺亡和/或找出真正溺亡区域的方法，具体为：取溺水者脏器组织，检测脏器组织中是否含有硅藻upa基因，根据检测结果判断溺亡者是否真正死于溺亡，以及找出真正的溺亡区域。

本发明具有以下优点：

1、本发明提出了硅藻upa基因在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。

2、本发明中提供了一种对硅藻upa基因的分析方法，提供了分析该基因序列的上游引物及下游引物，并同时提供了与硅藻upa基因相适配的荧光定量pcr扩增检测参数，并将该方法引用到利用硅藻upa基因判断溺亡者真正死因的应用中。

3、本发明还提供了将上述硅藻upa基因分析方法应用于法医检测中的应用，在溺亡者脏器中提取硅藻核酸并用荧光定量pcr扩增检测分析，然后与水样中的硅藻核酸进行比对，通过检出率和硅藻upa基因测序结果的比对，即可判断溺亡者是否真正死于溺亡，同时有助于找出真正的溺亡区域。

附图说明

图1为本发明中引物的primer-blast结果图；

图2为本发明中荧光定量检测硅藻标准株upa基因的扩增曲线结果图；

图3为本发明中引物扩增硅藻标准株扩增产物的ncbi-blast结果图

图4为本发明中检测脏器扩增产物测序图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1引物设计及引物特异性证明

根据硅藻的upa基因设计出一对上下游引物：

上游引物（如seqidno.1所示）：

5’-cagtgagataccacccttgtaatgtt-3’

下游引物（如seqidno.2所示）：

5’-tctagatacgatttctaaccgctcaga-3’

实施例2引物对的特异性验证

利用上述引物和探针对不同样本的dna进行实时荧光定量pcr检测，探针5’端以fam荧光报告基团标记，3’端以nfq-mgb荧光淬灭基团标记，选取五种常见硅藻、两种人体共生菌和多种非硅藻藻类dna做引物特异性验证。

1:小环藻；2：菱形藻；3：舟形藻；4：针杆藻；5：变异直链藻；6：大肠杆菌；7：双歧杆菌；8：杀鲑气单胞菌；9：维氏气单胞菌；10：温和气单胞菌；11：蛋白核小球藻；12：普通小球藻；13：斜生栅藻；14：镰形纤维藻；15：念珠藻；16：鱼腥藻；17：单岐藻；18：柔细束丝藻；19：产毒铜绿微囊藻；20：不产毒铜绿微囊藻；21：超纯水（阴性对照）

扩增后得到如附图2所示的扩增曲线图。由附图2可见只有五个硅藻样本出现扩增，对其他细菌和非硅藻藻类没有扩增曲线，对扩增产物进行测序，将测序所得序列在ncbi(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行blast比对，比对结果（附图3）显示为硅藻。即可证明上述引物可对硅藻进行特异性扩增。

本方法只需要荧光定量pcr即可进行硅藻检验，通过观察扩增曲线（常规pcr没有扩增曲线）即可判断是否为硅藻（扩增曲线起峰且ct值小于35即为硅藻）。

实施例3动物组对照实验

人为溺死实验猪组（n=15）、实验猪机械处死后入水组（n=15）和非溺死实验猪的空白对照组（n=5）肺脏、肝脏、肾脏（体循环脏器）的检材中提取的基因组dna在相同扩增体系下经本实施例1设计的引物探针进行实时荧光定量pcr扩增，规定出现扩增曲线且ct值（cyclethreshold）小于35即阳性扩增，结果判定为检出，检出率结果见表1。

表1硅藻upa基因在各组实验动物体循环脏器检出例数及阳性率

由上述实验结果可看出，利用本发明中的方法，对实验猪脏器中的dna进行扩增，利用阳性扩增结果来确认实验猪死因的方法检出率可达93%，考虑到溺亡过程中吸入水的不同及个体差异，可认定本发明中的方法可有效判定实验猪是否真正为溺死，同时可协助判断溺亡地点。

实施例4硅藻upa基因分析方法及在法医检测中的应用

利用实施例设计的引物对可以设计一种硅藻upa基因分析方法，本实施例中将本发明中的硅藻upa基因分析方法应用于法医检测中，具体应用于确认溺水者是否为溺亡以及寻找溺对应的溺亡区域。本实施例中采用的溺水者确认为真实溺水死亡人员。

法医检测步骤为如下：

步骤一：在通风橱中剪取溺水者肺脏、肝脏、肾脏组织；

步骤二：提取肺脏、肝脏、肾脏组织中的基因组dna；

步骤三：使用实施例1中的引物和探针进行实施荧光定量pcr扩增；

在步骤三中，扩增过程中使用的上游引物为5’-cagtgagataccacccttgtaatgtt-3’；下游引物为5’-tctagatacgatttctaaccgctcaga-3’；taqman探针为5’-cggaggcgtacaaag-3’；

探针5’端以fam荧光报告基团标记，3’端以nfq-mgb荧光淬灭基团标记，可以实现在荧光定量pcr仪中的实时定量检测。

实时荧光定量扩增检测反应体系为20ml：pcr反应体系为20ml：premixextaq（probeqpcr）试剂（2×）10ml，浓度为10μmol/l的正向引物0.4ml，浓度为10μmol/l的反向引物0.4ml，roxreferencedyeii（50×）0.2ml，探针0.8ml，dna模板2ml，灭菌双蒸水6.2ml。上述2×/50×含义为所使用的试剂浓度为最终其在扩增体系中浓度的2/50倍。

先混合扩增原料，dna模板最后加入扩增体系。对于特异性验证试验，dna模板指的是硅藻的基因组dna，对于案件检测实验，dna模板指的是检材基因组dna。这两者的基因组dna皆含有硅藻upa基因。

反应条件为:stage1：预变性95℃，30s，升温速率20℃/s，1cycle；stage2：pcr反应95℃，5s，升温速率20℃/s，60℃，34s，升温速率20℃/s，40cycles；在退火步骤进行荧光信号收集。

本实施例中，实时荧光定量分析使用的仪器为quantstudio7flex，也可采用其他有效实施荧光定量分析仪。

利用实时荧光定量分析仪检测水中尸体脏器的硅藻upa基因，具有阳性扩增即可确认为该样本中含有硅藻，该样本可判定为溺水死亡，结果表明与已知死因相符。

pcr扩增产物测序如附图4所示。

pcr扩增产物测序为：agtgagataccacccttgtaatgttagatttctaactttgaatcattatctggtcaaagaacagtttcaggcgggcagtttgactggggcggtcgcctcccaaatggtgacggaggcgtacaaaggtttcctctgagcggttagaaatcgtatctaga。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明实施例的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明实施例的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>广州市刑事科学技术研究所

<120>一种硅藻upa基因分析方法及其在法医检测中的应用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>引物β-actinf1

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<212>dna

<213>引物β-actinr1

<400>2

tctagatacgatttctaaccgctcaga27