一种基于激发发射光谱分离同时测量受体‑供体量子产额之比与消光系数之比的方法与流程

本发明属于荧光共振能量转移(fret)检测技术领域，具体涉及一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比(qa/qd)与受体-供体消光系数之比(ka/kd)的方法。

背景技术：

基于荧光蛋白(fps)的fret显微术已经成为在活细胞中研究分子调控机制的重要工具。获得不依赖于检测系统和fps表达水平的定量fret信号是不同实验室之间进行学术交流和比较的前提。近年来，我们在宽场光谱显微成像系统上实现了一种基于激发发射光谱分离的定量fret测量技术(exem-spfret)，能够同时克服受体激发串扰和供体发射串扰[mengyandu,etal.“wide-fieldmicroscopicfretimagingusingsimultaneousspectralunmixingofexcitationandemissionspectra”,opt.express24(14),16037-16051(2016)]。

受体-供体量子产额之比(qa/qd)与受体-供体消光系数之比(ka/kd)是许多定量fret检测技术必不可少的两个重要参量。ka/kd与激发光源的光谱性质、测量系统激发通道的传输函数以及供体和受体的吸收光谱有关。wlodarczyk[wlodarczykj,woehlera,kobef,etal.“analysisoffretsignalsinthepresenceoffreedonorsandacceptors”,biophysicaljournal94(3),986-1000(2008)]等人通过测量串联质粒样本在双波长激发时的激发比来得到ka/kd，该方法要求所有fret测量过程中系统设置保持不变。zhang[zhangj,yangf,chail,etal.“spectralmeasurementofacceptor-to-donorextinctioncoefficientratioinlivingcells”,micron68(1),98-106(2015)]等人提出的sp-ecr方法测量ka/kd时需要借助一个fret效率已知的串联质粒样本。对于qa/qd的值，大多数fret相关研究都是通过引用文献中报道的荧光基团的量子产额值得到。但是实际上qa/qd不仅与供体、受体荧光基团的光学性质有关，还与荧光基团所处的环境以及测量系统发射通道的光谱响应性能有关。所以，在给定的测量系统上同时且准确测得qa/qd和ka/kd的值是多种定量fret检测的前提条件。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比(qa/qd)与受体-供体消光系数之比(ka/kd)的方法。该方法利用2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且fret效率不同的供体-受体串联样本同时测量qa/qd和ka/kd。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

分别获得单转供体样本、单转受体样本以及2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且fret效率不同的供体-受体串联样本。通过线性分离供体-受体串联样本的激发发射光谱可以快速测定在给定的测量系统条件下qa/qd和ka/kd值，并且无需测量供体-受体串联样本的fret效率。

一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比(qa/qd)与受体-供体消光系数之比(ka/kd)的方法，包括以下步骤：

(1)测量2种或2种以上受体个数与供体个数比值(na/nd)相同且fret效率不同的供体-受体串联样本的激发发射光谱(sda[i])，并将sda[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]；其中下标i表示第i种供体-受体串联样本，i≥2；

(2)根据步骤(1)得到的wd[i]、wa[i]和ws[i]计算wa[i]/wd[i]和ws[i]/wd[i]的值；

(3)以wa/wd为自变量，ws/wd为因变量，线性拟合步骤(2)中得到的wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i]，线性方程的斜率与na/nd的乘积的倒数即为ka/kd，线性方程的截距的绝对值即为qa/qd。

步骤(1)中所述的三个激发发射光谱基矢分别为供体的激发发射光谱基矢sd、受体的激发发射光谱基矢sa、供受体敏化的激发发射光谱基矢ss；

步骤(1)中所述的wd[i]为供体激发发射光谱所占权重，wa[i]为受体激发发射光谱所占权重，ws[i]为供受体敏化激发发射光谱所占权重；

步骤(1)中所述的供体-受体串联样本适用于所有串联质粒的供体-受体串联样本，其中受体个数与供体个数比值(na/nd)优选为0.5～3；最优选为1：1。

具体包括以下步骤：

(1)获得单转供体样本和单转受体样本，测量供体的激发发射光谱基矢sd，受体的激发发射光谱基矢sa，以及供受体敏化的激发发射光谱基矢ss；

(2)获得2种或2种以上受体个数与供体个数比值(na/nd)相同且fret效率不同的供体-受体串联样本，测量供体-受体串联样本的激发发射光谱(sda[i])，并将sda[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]；

sda[i]＝wd[i]sd+ws[i]ss+wa[i]sa(2)

(3)根据步骤(2)得到的wd[i]、wa[i]和ws[i]计算wa[i]/wd[i]和ws[i]/wd[i]的值。

(4)以wa/wd为自变量，ws/wd为因变量线性拟合步骤(3)得到的wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i]，线性方程的斜率与na/nd的乘积的倒数即为ka/kd，线性方程的截距的绝对值即为qa/qd。其中，wa/wd、ws/wd、ka/kd和qa/qd四者满足如下关系：

为了更好的阐述本发明，下面以一个测量qa/qd和ka/kd的实例进行说明：

给定的供体-受体串联样本(na/nd＝1)：供体为cerulean(简称c)，受体为venus(简称v)。

供体-受体串联样本c32v：由32个氨基酸的连接序列将c和v链接组成的供体-受体串联样本。

供体-受体串联样本c17v：由17个氨基酸的连接序列将c和v链接组成的供体-受体串联样本。

供体-受体串联样本ctv：由229个氨基酸的连接序列将c和v链接组成的供体-受体串联样本。

具体测量过程如下：

(1)在人的肝癌细胞(hepg2细胞)中单独转染并表达供体c和受体v，以及供体-受体串联样本c32v、c17v和ctv；

(2)用宽场荧光显微镜和相机测量c和v的激发谱和发射谱。选择436±10nm和470±10nm两个激发波段作为激发光；选择470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六个发射波段作为探测通道。经过测量和计算可以得到归一化的c的激发谱和发射谱以及归一化的v的激发谱和发射谱

(3)根据和的外积得到供体的激发发射光谱基矢(sd)，和的外积得到受体的激发发射光谱基矢(sa)，以及和的外积得到供受体敏化的激发发射光谱基矢(ss)：

(4)测量供体-受体串联样本c32v、c17v和ctv的激发发射光谱(sda[i])。用436±10nm的激发光分别激发每个供体-受体串联样本，分别得到发射通道470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm下每个供体-受体串联样本的荧光强度；再用470±10nm的激发光分别激发每个供体-受体串联样本，分别得到发射通道510±10nm、530±10nm、550±10nm和585±20nm下每个供体-受体串联样本的荧光强度，从而得到每个供体-受体串联样本的激发发射光谱(sda[i])。

(5)根据公式(2)将sda[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子wd[i]、wa[i]和ws[i]。

sda[i]＝wd[i]sd+ws[i]ss+wa[i]sa(2)

(6)以wa/wd为自变量，ws/wd为因变量，线性拟合3个供体-受体串联样本的wa[i]/wd[i]，ws[i]/wd[i]，线性方程的斜率的倒数即为ka/kd，线性方程的截距的绝对值即为qa/qd。

本发明的基本原理如下：

(1)对于一个既含有自由的供体和自由的受体，又含有供体-受体对的fret样本其激发发射光谱为如下四种激发发射光谱的线性组合：自由供体的激发发射光谱、与受体结合成对的供体的激发发射光谱、供受体敏化的激发发射光谱和直接激发受体的激发发射光谱。如公式(3)所示。

其中，e是fret样本中成对的供体-受体的fret效率；cd是fret样本中自由的供体的浓度；cda是成对的供体-受体的浓度；是fret样本中受体的总浓度；

(2)简化公式(3)可得：

其中，为fret中供体的总浓度并且有：

(3)按受体浓度归一化的表观fret效率(ea)和按供体浓度归一化的表观fret效率(ed)可以表示为：

(4)联立公式(5)和公式(6)可得：

(5)对于受体个数与供体个数比值为na/nd的供体-受体串联样本，有ea×na＝ed×nd，则公式(7)可以写为：

(6)测量2种或2种以上受体个数与供体个数比值(na/nd)相同且fret效率不同的供体-受体串联样本可以得到多组wa/wd，ws/wd。以wa/wd为自变量，ws/wd为因变量对多组wa/wd，ws/wd进行线性拟合，拟合得到线性方程的斜率与na/nd的乘积的倒数即为ka/kd，线性方程的截距的绝对值即为qa/qd。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明是一种同时测量作为供体的荧光基团和作为受体的荧光基团在给定的测量系统条件下的qa/qd和ka/kd的方法，具有测量过程简单、测量时间短和测量结果稳定的优点。因此，本发明适用于不同的检测系统，对于活细胞fret定量检测具有重要的应用价值，必将极大地提高活细胞fret检测的成功率，从而推动fret定量检测技术在细胞生物学中的应用。

附图说明

图1是供体(sd)和受体(sa)以及供受体敏化(ss)的激发发射光谱基矢；其中，(a)左图为单转c和v的激发光谱图像；白色区域为所选发荧光的细胞区域(cell)，灰色区域为所选背景区域(bg)；(a)右图为根据(a)左图单转c和v对应的白色区域的平均光强减去灰色区域的平均光强得到的激发荧光光强谱；(b)左图为单转c和v的发射光谱图像；白色区域为所选发荧光的细胞区域(cell)，灰色区域为所选背景区域(bg)；(b)右图为根据(b)左图单转c和v对应的白色区域的平均光强减去灰色区域的平均光强得到的发射荧光光强谱；(c)左图是归一化的供体和受体的激发谱，(c)右图是归一化的供体和受体的发射谱；(d)是供体(sd)、受体(sa)和供受体敏化(ss)激发发射光谱基矢。

图2是利用供体-受体串联样本c32v测量三个权重系数的比值wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]；其中，(a)上图是表达c32v在hepg2细胞中的激发发射光谱图像；(a)中、下图分别是对应的wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]的伪彩图和柱形图；(b)是以wa/wd为自变量，ws/wd为因变量线性拟合c32v、c17v和ctv的wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i](i＝1，2，3)的平均值得到的线性方程表达式。其中线性方程的斜率的倒数即为ka/kd，线性方程的截距的绝对值即为qa/qd。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、质粒来源

供体质粒cerulean(c)、受体质粒为venus(v)与fret参照质粒c32v、c17v和ctv均购于美国addgene质粒库。

2.宽场光谱显微成像系统

宽场荧光显微镜产自日本奥林巴斯公司，型号为ix73。光源是日本奥林巴斯hglgps系列的汞灯。物镜是放大倍数为40、数值孔径为1.3(40×1.3na)的油镜，一个装有四个激发片的激发转轮，一个装有八个cube(每个cube中可安装激发片、分光片、发射片各一个)的转轮，一个装有六个发射片的电动发射转轮，外接一个ccd相机。激发光波长通过转动激发转轮进行选择。

3、细胞培养以及质粒转染

hepg2细胞来自中国广州暨南大学，用dmem培养基加入10％的新生牛血清放在含有5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养。细胞用胰蛋白酶消化，转到细胞培养皿中，培养24小时后，当细胞生长至70～90％时，用体外转染试剂turbofect^tm将质粒短暂转入细胞。

转染的具体步骤：(1)取两只灭菌的ep管，每个ep管中先加入40μl无血清的dmem，然后向一只ep管中加入1～2μl的转染试剂，另一只ep管中加入1～2μl(500～600ng/μl)的质粒，静置5分钟；(2)5分钟后，将两只ep管混匀，轻轻吹打6～8次后静置20分钟，(3)20分钟后，将420μl的无血清的dmem加入到刚刚混匀的ep管中，轻轻混匀；(4)用无血清的dmem培养基或pbs清洗培养皿中细胞2～3次，主要洗去死细胞等脏污，然后把上述的(3)中的混合物移到培养皿中，把培养皿重新放回培养箱中4～6小时；(5)4～6小时后，吸去转染液，然后用用无血清的dmem培养基或pbs清洗培养皿中细胞2～3次，再往培养皿中加入含有新生牛血清的dmem培养基，培养24～48小时即可用于实验。

4.测量供体-受体串联样本

4.1分别单转c样本、v样本以及供体-受体串联样本ctv、c17v和c32v，测量每种供体-受体串联样本中三个激发发射光谱各占的权重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]。

测量三个激发发射光谱基矢。将载有单独表达供体c和受体v的hepg2细胞的培养皿置于载物台，选择405±10nm、436±10nm、470±10nm和480±10nm四个激发波段作为激发光，470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六个发射波段作为探测通道，测得c和v的激发谱(图1(a))以及c和v的发射谱(图1(b))。归一化后得到的c的激发谱(图1(c)左)和发射谱(图1(c)右)；

将和代入公式(1)计算出供体的激发发射光谱基矢(sd)，受体的激发发射光谱基矢(sd)和供受体敏化的激发发射光谱基矢(ss)，如图1(d)所示。

利用供体-受体串联样本c32v、c17v和ctv测量三个激发发射光谱各占的权重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]。其中测得供体-受体串联样本c32v的激发发射光谱(sda[1])图像(如图2(a)上图所示)，将sda[1]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子wd[1]，wa[1]和ws[1]。并通过计算得到wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]的值。图2(a)中、下分别为对应的wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]的伪彩图和柱形图。统计14个视野大概36个细胞得到wa[1]/wd[1]＝0.699±0.014、ws[1]/wd[1]＝0.737±0.033；同样的方法测量c17v，统计13个视野大概32个细胞得到wa[2]/wd[2]＝0.786±0.027、ws[2]/wd[2]＝1.109±0.040；测量ctv，统计4个视野，大概14个细胞得到wa[3]/wd[3]＝0.498±0.002、ws[3]/wd[3]＝3.77×10^-6±7.33×10^-6。以wa/wd为自变量，ws/wd为因变量(i＝1，2，3)，线性拟合wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i]。得到的线性方程表达式如图2(b)所示，其中线性方程的斜率的倒数即ka/kd＝1/3.850，线性方程的截距的绝对值即qa/qd＝1.925。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。