一种利伐沙班含量检测试剂盒及其检测利伐沙班的方法与流程

本发明涉及利伐沙班检测
技术领域：
，具体涉及一种利伐沙班含量检测试剂盒及其检测利伐沙班的方法。
背景技术：
：利伐沙班是一种口服抗凝药物，目前已批准上市的利伐沙班药品有拜耳医药公司生产的利伐沙班片，其商品名为拜瑞妥。利伐沙班不需要任何辅助因子，直接结合到活化因子x上，从而抑制凝血，达到抗血凝的作用。口服后大约80％可以被人体吸收，2～4小时后达到最高浓度，在肝和肾功能正常的患者中的半衰期为7到11小时。在一些情况下，比如怀疑利伐沙班用量过多时，患者肝或肾功能不正常时，患者需要紧急手术时，或者患者出现血栓或大量出血时，则需要对利伐沙班的血液含量进行检测和调整，使其血液中的含量保持在正常的水平。目前用液相色谱质谱联用的方法可以准确的测量利伐沙班的含量，然而这种方法价格昂贵，操作繁琐。利伐沙班与肝素的本质区别在于它不需要抗凝血酶ⅲ参与，可直接拮抗各种状态的活化因子x(包括血浆中游离的、凝血酶原酶复合物中结合的和纤维蛋白中的活化因子x)，而肝素则需要有抗凝血酶ⅲ才能发挥作用。与其他相关丝氨酸蛋白酶相比，利伐沙班对活化因子x的选择性高达10000倍，通过抑制活化因子x可以中断凝血瀑布的内源性和外源性途径，从而抑制凝血酶的产生和血栓形成。相较于肝素，利伐沙班的药代动力学和药效学参数较少受性别、体重或年龄影响。但目前利伐沙班的检测主要利用凝血酶原时间(pt)或利用活化部分凝血活酶时间凝血酶原时间(aptt)等进行。凝血酶原时间(pt)是检测抗凝剂的常用指标，在抗凝剂的使用过程中，维持pt在正常对照的1～2倍最为适宜。利伐沙班可浓度依赖性地延长pt，且两者呈线性关系，但不同pt试剂对利伐沙班的敏感性相差较大，且在小剂量口服抗凝剂治疗时，pt不敏感。此外pt并非特异性的检测方法，且易受很多其他因素的影响(例如肝损害、恶性肿瘤所致维生素k缺乏)。将pt转换为国际化标准比值(inr)并未校正变异，甚至使变异增大。对利伐沙班而言，会使凝血指标国际化标准比值(inr)值出现假性升高，并不是衡量利伐沙班抗凝活性的有效指标，所以使用pt或inr来评价利伐沙班的抗凝活性所得到的结论并不准确。利伐沙班对活化部分凝血活酶时间(aptt)的敏感性相比凝血酶原时间(pt)较低，延长aptt的能力较弱，检测变异性大，低药物浓度时结果相互矛盾，不同试剂间也存在差异性；故aptt也不适合用于利伐沙班的检测。目前缺乏一种高效、准确检测利伐沙班含量的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利伐沙班含量检测试剂盒及其检测利伐沙班的方法。本发明提供的检测试剂盒稳定性和重复性好，能准确反应利伐沙班含量。本发明提供了一种利伐沙班含量检测试剂盒，包括分装的活化x因子试剂和发色底物试剂；所述发色底物试剂包括以下发色底物中的任意一种：ch3so2-d-leu-gly-arg-p-nitroanilide·acoh；ch3oco-d-chg-gly-arg-p-nitroanilide·acoh；ch3oco-d-cha-gly-arg-p-nitroanilide·acoh；benzoyl-ile-glu-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；suc-ile-glu(γ-piperidyl)-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；n-α-z-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl；boc-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；acetyl-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl；4-nz-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl；4-mbs-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl。优选的是，所述活化x因子试剂在使用过程中活化x因子的浓度为0.75～0.85u/ml，溶剂为水。优选的是，所述活化x因子试剂还包括以下助剂：三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、peg8000、bsa和叠氮钠；试剂使用过程中各助剂的浓度为：10～50mm的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.3m的氯化钠、质量浓度为0.5～1％的peg8000、质量浓度为0.05～0.1％的bsa和质量浓度为0.05～0.1％的叠氮钠。优选的是，所述活化x因子试剂的ph值为7.4～7.6。优选的是，所述发色底物试剂在使用过程中发色底物的浓度为0.40～0.60mm，溶剂为水。优选的是，所述发色底物试剂的还包括以下助剂：三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、peg8000和叠氮钠；试剂使用过程中各助剂的浓度为：10～50mm的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.3m的氯化钠、质量浓度为0.5～1％的peg8000和质量浓度为0.05～0.1％的叠氮钠。优选的是，所述发色底物试剂的ph值为7.4～7.6。优选的是，所述活化x因子试剂的制备方法包括以下步骤：配制三羟甲基氨基甲烷水溶液，将活化x因子与三羟甲基氨基甲烷水溶液混合，调节ph值至7.4～7.6，依次加入氯化钠、peg8000、bsa和叠氮钠，18～25℃下搅拌10分钟。优选的是，所述发色底物试剂的制备方法包括以下步骤：配制三羟甲基氨基甲烷水溶液，将发色底物与三羟甲基氨基甲烷水溶液混合，调节ph值至7.4～7.6，再依次加入氯化钠、peg8000和叠氮钠，18～25℃下搅拌10分钟。本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒检测利伐沙班含量的方法，包括以下步骤：将待测样品与活化x因子试剂混合孵育后，再加入发色底物试剂混合孵育后，读取待测样品中发色底物的信号强度；根据所述读取得到的信号强度和已知浓度校准品的标准曲线比对，得到待测样品中利伐沙班含量。本发明提供了一种利伐沙班含量检测试剂盒。本发明结合活化x因子试剂和发色底物试剂实现对利伐沙班含量的检测。活化x因子加入含有利伐沙班的血浆后,其活性会被利伐沙班抑制,而剩余的未被抑制的活化x因子则与其特异性的发色底物反应,产生吸光度信号。利伐沙班含量越高,对活化x因子的抑制越强,得到的吸光度信号越低。本发明利用利伐沙班含量和吸光度信号成反比关系来检测利伐沙班含量，本发明相比于活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血酶原时间(pt)检测法，比例线性非常好,利伐沙班含量检测更精准。本发明提供的检测试剂盒稳定性和重复性好，能准确反应利伐沙班含量。附图说明图1为本发明实施例1提供的利用生化仪测定的利伐沙班标准曲线；图2为本发明实施例3提供的利用血凝仪测定的利伐沙班标准曲线；图3为本发明实施例7提供的利用生化仪测定的利伐沙班标准曲线；图4为本发明实施例8提供的利用生化仪测定的利伐沙班标准曲线；图5为本发明实施例9提供的利用血凝仪测定的利伐沙班标准曲线。具体实施方式本发明提供了一种利伐沙班含量检测试剂盒，包括分装的活化x因子试剂和发色底物试剂；所述发色底物试剂包括以下发色底物中的任一一种：ch3so2-d-leu-gly-arg-p-nitroanilide·acoh；ch3oco-d-chg-gly-arg-p-nitroanilide·acoh；ch3oco-d-cha-gly-arg-p-nitroanilide·acoh；benzoyl-ile-glu-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；suc-ile-glu(γ-piperidyl)-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；n-α-z-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl；boc-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；acetyl-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl；4-nz-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl；4-mbs-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl。本发明所述利伐沙班含量检测试剂盒包括分装的活化x因子试剂和发色底物试剂。本发明对所述活化x因子(fxa)的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的活化x因子的常规市售产品即可，本发明所述活化x因子的来源优选为人、牛或猪，更优选为牛。在本发明中，所述活化x因子试剂在使用过程中活化x因子的浓度为0.75～0.85u/ml，溶剂为水。在本发明中，所述活化x因子试剂还包括以下助剂：三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、peg8000、bsa和叠氮钠，试剂使用过程中各助剂的浓度为：10～50mm的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.3m的氯化钠、质量浓度为0.5～1％的peg8000、质量浓度为0.05～0.1％的bsa和质量浓度为0.05～0.1％的叠氮钠。本发明所述试剂盒中的活化x因子试剂的剂型优选为溶液或冻干剂，优选为冻干粉剂,有利于长期保存。剂型为溶液的试剂盒可以直接使用,而剂型为冻干剂的试剂盒在使用前应将各组分对应的冻干粉溶于水制备成溶液。在本发明中，所述活化x因子试剂的ph值为7.4～7.6。在本发明中，所述活化x因子试剂的制备方法包括以下步骤：配制三羟甲基氨基甲烷水溶液，将活化x因子与三羟甲基氨基甲烷水溶液混合，调节ph值至7.4～7.6，依次加入氯化钠、peg8000、bsa和叠氮钠，18～25℃下搅拌10分钟。在本发明中，优选将得到的活化x因子试剂制成冻干粉进行保存，本发明对所述冻干操作条件参数没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的冻干粉制备方法条件即可。在本发明中，所述发色底物试剂在使用过程中发色底物的浓度为0.40～0.60mm，溶剂为水。在本发明中，所述发色底物为以下组分中的任意一种：ch3so2-d-leu-gly-arg-p-nitroanilide·acoh、ch3oco-d-chg-gly-arg-p-nitroanilide·acoh、ch3oco-d-cha-gly-arg-p-nitroanilide·acoh、benzoyl-ile-glu-gly-arg-p-nitroanilide·hcl、suc-ile-glu(γ-piperidyl)-gly-arg-p-nitroanilide·hcl、n-α-z-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl、boc-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·hcl；acetyl-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl、4-nz-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl、4-mbs-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl。本发明对所述发色底物的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的上述发色底物的常规市售产品即可。在本发明中，所述发色底物试剂的还包括以下助剂：三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、peg8000和叠氮钠；试剂使用过程中各助剂的浓度为：10～50mm的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.3m的氯化钠、质量浓度为0.5～1％的peg8000和质量浓度为0.05～0.1％的叠氮钠。本发明所述试剂盒中的发色底物试剂的剂型优选为溶液或冻干剂，优选为冻干粉剂有利于长期保存。剂型为溶液的试剂盒可以直接使用,而剂型为冻干剂的试剂盒在使用前应将各组分对应的冻干粉溶于水制备成溶液。在本发明中，所述发色底物试剂的ph值为7.4～7.6。在本发明中，所述发色底物试剂的制备方法包括以下步骤：配制三羟甲基氨基甲烷水溶液，将发色底物与三羟甲基氨基甲烷水溶液混合，调节ph值至7.4～7.6，再依次加入氯化钠、peg8000和叠氮钠，18～25℃下搅拌10分钟。在本发明中，优选将得到的发色底物试剂制成冻干粉进行保存，本发明对所述冻干操作条件参数没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的冻干粉制备方法条件即可。本发明对所述ph值的调节方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的ph调节剂进行调节即可，如用1mhcl来调节ph值。本发明检测利伐沙班含量的原理如下。活化x因子加入含有利伐沙班的血浆后,其活性会被利伐沙班抑制,而剩余的未被抑制的活化x因子则与其特异性的发色底物反应,产生吸光度信号。利伐沙班含量越高,对活化x因子的抑制越强,得到的吸光度信号越低。本发明利伐沙班含量和吸光度信号成反比关系来检测利伐沙班含量。本发明所述试剂盒能够用于利伐沙班的检测，在检测过程中，选取含有利伐沙班的人血浆校准品作为对照，本发明对所述人血浆校准品的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的人血浆常规市售产品。在本发明中，所述人血浆校准品优选加入稳定剂和防腐剂，经冷冻干燥后进行备用。本发明所述含有利伐沙班的人血浆校准品优选由利伐沙班和人血浆人工配制得到。本发明所述利伐沙班的检测方法包括以下步骤：将待测样品与活化x因子试剂混合孵育后，再加入发色底物试剂混合孵育后，读取待测样品中发色底物的信号强度；根据所述读取得到的信号强度和已知浓度的校准品的标准曲线比对，得到待测样品中利伐沙班含量。在本发明中，所述孵育的条件独立地选为37℃，孵育1～5分钟。在本发明的检测过程中，所述活化x因子试剂在使用过程中活化x因子的浓度为0.75～0.85u/ml，所述发色底物试剂在使用过程中发色底物的浓度为0.40～0.60mm。在本发明中，信号检测优选采用自动监测仪进行，本发明所述自动检测仪优选包括血凝分析仪和生化分析仪。具体的，在检测过程中，反应的温度优选为37℃，检测波长优选为405nm，检测方法优选为终点法或动态法。本发明在使用不同的自动检测仪优选根据仪器的不同对参数进行相应调整。在本发明中，所述待测样本的制备方法优选包括以下步骤：将血液按9：1的比例与枸橼酸抗凝液(0.11mol/l)混匀，1小时内以至少2500g离心力，18～25℃下离心15分钟，分离得到血浆,即待测样本。下面结合具体实施例对本发明所述的一种利伐沙班含量检测试剂盒及其检测利伐沙班的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1制备本发明提供的试剂盒，包含活化因子x试剂和发色底物试剂，用于测定血浆中利伐沙班含量。具体为：发色底物试剂的具体制备方法为：取ch3o-co-d-cha-gly-arg-p-nitroanilide·acoh溶于浓度为20mm的tris缓冲液，再加入盐酸调节ph值至7.6；再加入氯化钠，peg8000和叠氮钠，搅拌后制得发色底物试剂，其工作浓度(使用过程中的终浓度)分别为:ch3o-co-d-cha-gly-arg-p-nitroanilide·acoh0.5mm，tris20mm，氯化钠0.15m，peg80001g/l，叠氮钠0.1％。活化因子x试剂的具体制备方法为：取购自西格马(sigma)公司的活化因子x溶于浓度为20mm的tris缓冲液，再加入盐酸调节ph值至7.6；再加入氯化钠，peg8000，bsa和叠氮钠，搅拌后制得活化因子x试剂，其工作浓度分别为:活化因子x0.8u/ml，tris20mm，氯化钠0.15m，peg80001g/l，叠氮钠0.1％。含利伐沙班的人血浆校准液的制备：配制多个已知浓度的含有利伐沙班的人血浆校准液，利伐沙班的浓度分别为0ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml和400ng/ml。标准曲线制作(生化仪)：(1)分别取5μl不同浓度的校准液加入45μl稀释液与100μl活化因子x试剂混合均匀，孵育5分钟，读取吸光度值a1(405nm波长测量吸光度)，孵育和反应的温度均为37℃，所述稀释液为tris20mm，氯化钠0.15m,ph值7.6。(2)然后加入100μl发色底物试剂，混合均匀，继续孵育5分钟，读取吸光度值a2(405nm波长测量吸光度)，孵育和反应的温度均为37℃。(3)用a2-a1计算出加入发色底物试剂前后的吸光度差值△a。(4)根据利伐沙班校准液浓度与所对应吸光值差值，采用线性方程绘制标准曲线，请见图1。图1表明本发明可以提供能够满足检测要求的,线性极好的标准曲线。实施例2用实施例1中得到的标准曲线进行样品检测(生化仪)：取5μl的待测样品加入45μl稀释液与100μl活化因子x试剂混合均匀，37℃孵育5分钟并在405nm处测试吸光度值，然后加入100μl发色底物试剂，37℃条件下孵育5分钟再次记录吸光度值(405nm)，计算吸光度差值。记录试验结果，计算信号强度，和标准曲线比对得到利伐沙班含量。结果见表1。表1生化仪利伐沙班样本检测。表中数值的单位为ng/ml测试1测试2测试3均值样本1119117120118.7样本2284282283283结果表明本发明检测利伐沙班含量的重复性非常好。实施例3本实施例与实施例1的不同仅在于标准曲线的绘制是在血凝仪上进行的。标准曲线绘制(血凝仪)(1)取5μl不同浓度的校准液加入45μl稀释液与100μl活化因子x试剂混合均匀。(2)然后加入100μl发色底物试剂，混合均匀，孵育30秒后开始读取od值到60秒结束(405nm波长处读值)，孵育和反应的温度均为37℃。(3)计算出加入发色底物试剂30秒到60秒之间的od值随时间周期的变化。(4)根据利伐沙班标准液浓度与所对od值变化度，采用线性方程绘制标准曲线，请见图2。图2表明本发明在血凝仪上也可以提供能够满足检测要求的,线性极好的标准曲线。实施例4本实施例与实施例2的不同仅在于本实施例中的检测是在血凝仪上进行的。样品检测(血凝仪)：取5μl待测样品加入45μl稀释液与100μl活化因子x试剂混合均匀，然后加入100μl发色底物试剂，37℃条件下孵育30秒，读取od值到60秒为止(405nm)，计算吸光度随时间变化。记录试验结果，计算信号强度，和标准曲线比对得到利伐沙班含量。结果见表2。本实施例中如实施例1方法制备活化因子x试剂和发色底物试剂，多次测定样本中的利伐沙班含量，确定其重复性是否能满足临床质控的要求(3个样本各重复20次)。检测结果见表2。表2血凝仪利伐沙班样本检测。表中数值的单位为ng/ml测试次数均值标准差变异系数(cv)样本12088.71.341.51％样本2202561.330.52％样本320435.12.330.54％结果表明本发明检测样本的重复性非常好,能满足临床质控的要求。实施例5本实施例中如实施例1方法制备活化因子x试剂和发色底物试剂。然后用本发明制作的试剂盒，检测利伐沙班校准品含量结果进行对比(3个值各测10次，计算其均值和靶值之间偏差)，确定其准确度在要求范围内，结果见表3。表3利伐沙班校准品检测。表中数值的单位为ng/ml结果表明本发明检测利伐沙班样本含量的准确度非常好,在要求范围之内。实施例6对本发明的试剂盒进行长期稳定性的追踪。在符合2类医疗器械的条件下如上述实施例1方法制备好试剂，并将其储存于2-8℃的冷藏条件下。每隔3个月进行一次性能验证(测试质控)，进行总周期为15个月的稳定性跟踪测试，其性能指标变化不超过10％，证实本发明试剂盒符合临床质控要求，测试结果见表4。表4试剂稳定性检测。表中数值的单位为ng/ml结果表明本发明的试剂盒稳定至少一年。实施例7本实施例与实施例1的不同仅在于所使用的发色底物为suc-ile-glu(γ-piperidyl)-gly-arg-p-nitroanilide·hcl。所得标准曲线请见图3。图3表明本发色底物也可以提供能够满足检测要求的,线性极好的标准曲线。实施例8本实施例与实施例1的不同仅在于所使用的发色底物为n-α-z-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl。所得标准曲线请见图4。图4表明本发色底物也可以提供能够满足检测要求的,线性极好的标准曲线。实施例9本实施例与实施例3的不同仅在于所使用的发色底物为acetyl-d-arg-gly-arg-p-nitroanilide·2hcl。所得标准曲线请见图5。图5表明本发色底物也可以提供能够满足检测要求的,线性极好的标准曲线。本发明利用发色底物法来检测利伐沙班含量。可以较快找到利伐沙班的最佳剂量范围，患者无需进行多次检测。此外，本发明还可用在自动化仪器如血凝分析仪或生化分析仪上，实现自动化有助于临床推广应用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12