一种甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡的制作方法

本实用新型属于免疫胶体金快速检测领域，具体涉及一种甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡。

背景技术：

甲硝唑化学名为2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇，属于硝基咪唑类抗菌药，具有抗厌氧菌和抗原虫的作用，主要用于治疗鸡、火鸡组织滴虫病、牛毛滴虫病，还可与其它抗生素联合，用于治疗厌氧菌感染。此外，该类药物还能促进牛、猪等动物的生长，常被用作饲料药物添加剂。因而极易造成动物源性食品中甲硝唑的残留。研究表明，甲硝唑对人体有多种毒副作用，包括消化系统、神经系统、心血管系统、皮肤症状、泌尿系统等的毒副作用。此外，甲硝唑还具有潜在的致癌作用。

为了食品安全，各国都出台了相应政策，1998年，欧盟禁止甲硝唑用于动物食品；2002 年，美国FDA禁止在进口动物源性食品中使用甲硝唑及其它硝基咪唑类药物；2003年，加拿大禁止所有5-硝基咪唑类化合物作为兽药在食品中使用；2002年，我国农业部第236号公告规定，在食源性动物中禁用甲硝唑。尽管如此，动物源性食品中甲硝唑残留事件时有发生，因此，检测动物源性食品、饲料中甲硝唑的含量对保障食品质量安全具有重要意义。

当前，食品中甲硝唑残留的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、加压毛细血管法、碳糊电极法、酶联免疫分析法等。虽然上述方法灵敏度高、准确性好，能够定量检测食品中甲硝唑的残留量，但是对实验设备及操作人员的要求高，不适用于现场快速检测。

技术实现要素：

本实用新型提供一种现场快速检测甲硝唑的免疫胶体金试剂卡可用于检测甲硝唑的残留，检测样品可为蜂产品、水产品、鸡蛋、奶制品等。本实用新型试剂卡灵敏度高、特异性好、重复性好、检测时间短，适用于现场快速检测。

本实用新型试剂卡包括底板和塑料卡套，其特征在于所述底板由PVC板，以及依次黏贴在PVC板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水材料垫组成，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水材料垫首尾均有1～2mm的重叠，所述硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫依次喷有相距5～6mm并与胶体金结合垫平行的检测线和控制线，所述检测线上包被有甲硝唑-牛血清白蛋白偶联物，所述控制线上包被羊抗鼠IgG。

进一步，塑料卡套正面设置有加样孔与观察区，所述加样孔呈漏斗状，所述塑料卡套内具有固定底板的凹槽，通过卡槽与卡突结合来固定底板。

进一步，加样孔对应的是底板上的样品垫，观察区对应的是底板上的硝酸纤维素膜，所述加样孔与观察区的长度与宽度分别略小于样品垫和硝酸纤维素膜。

进一步，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由玻璃纤维或聚酯膜制成，吸水材料垫为滤纸。

进一步，胶体金结合垫上包被有抗甲硝唑单克隆抗体-胶体金结合物。

本实用新型试剂卡利用抗体免疫竞争原理，通过抗原与金标抗体的显色反应特异性检测样品中甲硝唑的残留。当样品溶液中有甲硝唑残留时，甲硝唑先与胶体金颗粒上的特异性抗体结合。因此当胶体金颗粒随样品扩散至检测线时，由于胶体金颗粒上特异性抗体的活性位点被样品中的甲硝唑占据而无法与检测线上甲硝唑特异性抗原结合；当样品中甲硝唑残留量超出试剂卡的检出限时，检测线显色较控制线浅或者不显色，判断结果为阳性。当样品中甲硝唑残留量低于试剂卡检出限时，检测线显色较控制线深，判断结果为阴性。

本实用新型试剂卡各部分作用如下：

样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水材料垫首尾均有部分重叠可以做到更快速的层析。

检测线与控制线与胶体金结合垫平行可以使样品在层析过程中充分与检测线、控制线上的抗原/抗体反应，实验结果显示更明显。

加样孔呈漏斗状可以防止加样过程中样品液溅出而影响实验结果。

加样孔的长度和宽度略小于样品垫可以放置样品溶液滴出样品垫外，观察区的长度和宽度略小于硝酸纤维素膜可以防止外部杂质进入卡套腔内，并固定硝酸纤维素膜。

本实用新型具有如下有益效果：

(1)高灵敏度。本实用新型对蜂蜜中甲硝唑检出限为1μg/kg，在同类检测中达到了较优水平。

(2)高特异性。本实用新型以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，对甲硝唑的交叉反应率为100％，具有高度专一性。

(3)操作简单快速。本实用新型操作简单且不依赖大型试验设备，滴样后3-5min即可用肉眼判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线颜色的深浅来读取结果。

(4)成本低。本实用新型生产工艺简单，流程成熟。生产成本低，投资少，收效快。

附图说明

图1为甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡结构示意图，其中1为卡槽与卡突结合部，2 为加样孔，3为样品垫，4为胶体金结合垫，5为硝酸纤维素膜，6为检测线，7为控制线，8 为不干胶，9为PVC板，10为吸水材料垫，11为观察区。

图2为甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡结果读取示意图，其中T为检测线，C为控制线；图2-a中T线颜色比C线深或者一样深，为阴性；图2-b中T线颜色比C线浅或T线消失，为阳性；图2-c中C线消失，为无效。

具体实施方式

实施例一甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡的制备

本实用新型试剂卡的制备主要包括甲硝唑-载体蛋白偶联物的合成、甲硝唑单克隆抗体的制备、胶体金溶液的配置、甲硝唑单克隆抗体-胶体金结合物的制备以及胶体金试纸条的组装。

1、甲硝唑-载体蛋白偶联物的合成

1.1甲硝唑半抗原的合成

将溶解于6mL无水吡啶的585mg琥珀酸酐加入到500mg甲硝唑中(甲硝唑∶琥珀酸酐＝1∶2)，60℃油浴9h，旋蒸除尽吡啶，得油状粗产物。加入4℃预冷氯仿和冰水萃取，收集氯仿层。加入无水硫酸钠脱水，搅拌4h后静置2h，过滤除去硫酸钠，收集滤液，除去氯仿后真空干燥3h，得到黄色粉末即为甲硝唑半抗原，4-(2-(2-甲基-5-硝基咪唑)-4-氧代)丁酸MSA。

2.2甲硝唑-牛血清白蛋白(MSA-BSA)及甲硝唑-卵清蛋白(MSA-OVA)的合成

取8mg MSA溶于1mL DMF中，依次加入EDC 12mg，NHS 7mg，室温避光搅拌16h得到活化酯。取30mg BSA溶于6mL PBS，将活化酯缓慢滴加到BSA中，4℃搅拌反应24h，用0.01mol/L PBS(pH7.4)透析3d，分装且4℃保存。

将BSA换成OVA，用同样的方法，合成MSA-OVA。

2、甲硝唑单克隆抗体的制备

选取6～8周龄雌性BALB/c小鼠，取MSA-BSA偶联物，20μg/只小鼠，加生理盐水50μl，与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按每只小鼠100μl进行初免，颈部、皮下多点注射。之后每隔两周加强免疫一次，以不完全佐剂。融合前3d，不加佐剂，腹腔免疫1次。

免疫鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按5∶1的比例混合细胞，在50％PEG作用下促进细胞融合，之后置于37℃，体积分数为5％的CO₂培养箱中，以HAT培养基筛选融合的细胞。用间接抑制ELISA进行阳性筛选。

腹水McAb的制备：BALB/c小鼠腹腔注射灭菌的0.5mL液体石蜡，7～17d后以相同方法注射单抗细胞1×10⁶～2×10⁶个，10d后抽取腹水，离心去除油脂沉淀后即得到小鼠腹水McAb。

3、胶体金溶液的配置

称取一定量氯金酸，加超纯水得到0.01％氯金酸水溶液，取100mL加热至煮沸，边搅拌边加入1.5mL 1％柠檬酸三钠溶液。继续加热煮沸至溶液呈酒红色，冷却至室温，加超纯水恢复至原体积，4℃储存。

4、甲硝唑单克隆抗体-胶体金结合物的制备

取已制备好的胶体金溶液50mL，调至标记pH值，边搅拌边加入最适浓度的单克隆抗体，继续搅拌20min，后加入5％的BSA至最终质量分数为1％。在4℃下，1500r/min离心10min 后弃上清，所得沉淀用0.01mol/LPB溶液(1％BSA和0.05％NaN₃)重悬，置于4℃保存。

5、胶体金试纸条的组装

将稀释好的MSA-BSA和羊抗鼠IgG通过点膜机喷于NC膜上，形成间隔5mm的检测线 (T线)和控制线(C线)，37℃烘箱干燥7h；甲硝唑单克隆抗体-胶体金结合物按3μL/cm喷至玻璃纤维上制成胶体金结合垫，37℃烘箱干燥8h；依次将样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸水垫黏于PVC板上，用切条机切成4.00mm宽度的试纸条，装入下塑料模板的凹槽中，卡槽与卡突结合固定成试剂卡，再放入带有干燥剂的铝箔袋中密封保存。

实施例二甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡的使用方法

1、样品制备

取蜂蜜样品4g，加入1mL MNZA液，振荡混匀，加入8mL乙酸乙酯上下反转振荡3min，静置后取上清4mL吹干，加300μL复溶液复溶，取100μL待检。

2、操作方法

将试剂卡和待检样品溶液恢复至室温。将试剂卡从铝箔袋中取出，水平放置于观察者正面，用滴管吸取待检样品溶液于加样孔中垂直滴加3滴(约100μL)，加样后开始计时，在 3～5min内判读结果，其它时间判读无效。

3、结果判读

本实验采用对比法判读实验结果。若T线(检测线，靠近加样孔一端)显色比C线(控制线)显色深或一样深，判定为阴性；若T线显色比C线显色浅，或T线无显色，判定结果为阳性；若C线未出现则判定为无效。

实施例三甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡的检出限测定

1、操作步骤

取蜂蜜样品4g，加入甲硝唑标准溶液至终浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/kg，再按照实施例二的使用方法进行样品处理，用实例一制备的试剂卡分别对其进行检测。阴性对照为0.01mol/LPBS溶液。每组设6个平行样。

2、实验结果

实验结果如表1所示，检测线颜色呈梯度递增。在阴性对照及甲硝唑终浓度为0.25、0.5 μg/kg范围内，C线显色而T线不显色；1.0～4.0μg/kg范围内C线与T线显色。实验过程中，各组平行样均显色稳定。实验结果表明，本试剂卡的甲硝唑检测限为1.0μg/kg。

表1甲硝唑免疫胶体金快速检测试剂卡检出限

^a浓度单位：μg/kg；^b显色程度：-代表不显色，+代表显色；^c稳定性：-代表不稳定，+代表稳定。