一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器及应用的制作方法

本发明涉及一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器及应用，属于生物分子检测技术领域。

背景技术：

流行性感冒病毒，简称流感病毒，属于正黏液病毒科，是一种单股负链RNA病毒，它会造成急性上呼吸道感染，并通过呼吸、讲话等途径借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。新的亚型流感病毒造成的流感大流行威胁到人类的健康，随着人类经济及文化的全球化，为流感全球性大流行创造了合适的条件。为实现流感病毒传播的潜伏期进行检测与预防，一些简便的仪器及快速低成本的检测方法受到极大关注。预防流感病毒和可能的流感大流行的最重要的先决条件是尽早隔离，检测病毒核酸存在。发展新型流感病毒检测方法意义重大，重在改善方法的条件和属性，以达到易操作，便携式仪表，快速测试和低成本等要求。

分子印迹技术，是模拟自然界所存在的分子识别作用，制备包裹模板分子的聚合物网状结构的人工受体，它是涉及高分子化学、生物化学、材料化学、分析化学等学科的一种用于分离纯化的先进技术。 基于“分子印迹聚合物（MIPs）”取代生物分子作为识别元件仿生传感器， 在 21 世纪逐渐成为传感器领域的研究热点， 可望在将来逐步取代不稳定的传统生物传感器。迄今，分子印迹技术已被成功应用于小分子识别，由于生物分子的特殊性质，如大的分子尺寸，复杂的空间结构，大量的功能基团，水溶性等，对生物分子的印迹技术仍然为国内外研究的重点与难点。当目标物分子尺寸进一步放大到病毒颗粒时，又将遇到新的困难与挑战，因此关于分子印迹技术在病毒中的应用少有报道。然而由病毒引起的疾病不容小觑，如流感病毒引起的大流行，严重危害到人类健康，甚至是生命安全。这种仿生识别技术在病毒的制备、诊断及最终治疗方面具有一定的潜在应用。

传统的酶联免疫分析（ELISA）是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，利用其对目标物的特异性识别能力，采用酶标记技术进行信号的转换和放大，达到定性与定量分析的目的。如能将这种具有人工抗体性质的分子印迹材料与免疫技术相结合，将为生物分子分析提供一个全新的手段，而这一手段的优势在于对那些低丰度或难以获取抗体的生物分子可以实现直接的分析与检测，所消耗的模板分子量少，且有着比抗体更好的稳定性和重复性，一定程度上可以取代免疫分析中的抗体。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，并将其应用于血清样品的检测。该荧光传感器提供了一种高特异性，高灵敏的流感病毒识别与检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

将一定量流感病毒作为模板分子固定于96孔酶标板上，接着制备一层聚苯胺分子印迹膜，洗去模板病毒，形成的分子印迹膜可特异性识别目标病毒，并通过辣根过氧化物酶HRP标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面，被吸附的HRP催化过氧化氢 (H2O2) –邻苯二胺 (OPDA) 体系产生灵敏的荧光效应，从而构建一种新型流感病毒荧光传感器，可用于血清样品中流感病毒的识别与检测。

所述一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器的制备，具体步骤如下：

1） 模板分子的固定：于96孔酶标板中，每孔加入30 μL一定浓度的流感病毒，室温孵育1小时，超纯水洗去未键合的病毒颗粒；

2）分子印迹膜的制备：苯胺与过硫酸铵APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中预聚合，并加入到步骤（1）处理后的96孔酶标板的板孔中，每孔加入50 μL，孵育一定时间，超纯水洗去未聚合的反应物，200 μL洗脱液孵化一定时间，洗去模板病毒，超纯水水洗去残留洗脱液；

3）印迹膜的识别目标病毒：取一定浓度范围的目标流感病毒入到步骤（2）得到的96孔酶标板的板孔中，每孔加入30 μL，孵育一定时间，超纯水洗去未吸附的目标病毒；

4）HRP标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面：吸附了目标病毒的96孔酶标板中加入50 μL一定浓度HRP溶液，轻轻的震动，室温孵化一定时间，超纯水洗去未吸附的HRP；

5）光化学反应：新鲜配制一定浓度的 H2O2溶液和OPDA避光保存，二者等体积混合，向步骤（4）获得的96孔酶标板中每孔加入100 μL，避光37℃恒温一定时间，测定荧光强度，激发波长为468 nm，最大发射波长567nm 处的荧光强度作为定量分析的依据。

在步骤1）中的流感病毒浓度为20~50 μg/mL，步骤1）中的模板分子是流感病毒H1N1,H3N2, H5N1中的一种，或者是糖蛋白中的刀豆蛋白、植物血球凝集素中的一种。

在步骤2）中的洗脱液为10% HAc（v/v）,10% SDS（w/v）,10% HAc（v/v）和1% SDS（w/v）的混合液，1 mol/L NaCl中的一种，洗脱时间为20 ~120 min。

在步骤3）中的流感病毒浓度为0.01~1.0 μg/mL。

在步骤4）中的HRP浓度为0.01~0.1 mg/mL, HRP孵化时间20 ~80 min。

在步骤5）中的H2O2浓度为0.5~2.0 mmol/L, OPDA 浓度为0.5~2.0 mg/mL，两者要求新鲜配置，避光保存，保存时间不超过2小时，37℃恒温时间为5 ~20 min。

所述一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器的在血清样品中流感病毒检测的应用，具体为：

血清样品分析：于稀释20倍的胎牛血清溶液中，添加一定浓度的流感病毒（目标病毒），使流感病毒终浓度为1.0 μg/mL，加入到96孔酶标板的分子印迹膜上，孵化一定时间，进行HRP标记和光化学反应及荧光检测，并计算添加回收率。

其中流感病毒添加浓度为0.05~1.0 μg/mL，回收率在70~110%之间。

与现有技术相比，本发明构建的一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，并将其应用于血清样品的检测。有如下的优点：

（1）本发明结合分子印迹技术的高选择性及荧光分析的高灵敏性，大大提高了所构建传感器的灵敏度、选择性；

（2）本发明所采用的分子印迹技术成功应用于大颗粒流感病毒，且模板分子消耗量少，适合于低丰度生物大分子；

（3）本发明结合了分子印迹和酶联免疫两种技术的优点，同时克服了各自的局限性，为那种没有合适抗体的生物分子提供一种新的分析方法，该方法可以扩展到其他糖类生物大分子的识别。

（4）本发明应用于血清样品分析，其回收率满足要求。

附图说明

图1 所构建荧光传感器识别不同浓度流感病毒H1N1的荧光光谱图；

图2 所构建荧光传感器识别不同浓度流感病毒H1N1的吸附等温线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，具体步骤如下：

1） 模板分子的固定：于96孔酶标板中，每孔加入30 μL 50 μg/mL的流感病毒H1N1，室温孵育1小时，超纯水洗去未键合的病毒颗粒；

2）聚合物薄膜的制备：苯胺与APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中预聚合，每孔加入50 μL，孵育30 min，超纯水洗去未聚合的反应物，200 μL1 mol/L NaCl孵化90 min，洗去模板病毒，超纯水水洗去残留洗脱液；

3）印迹膜的识别目标病毒：取30 μL 0.01~1.0 μg/mL的流感病H1N1，孵育60 min，超纯水洗去未吸附的目标病毒；

4）HRP标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面：吸附了目标病毒的微孔板中加入50μL 0.05 mg/mL HRP溶液，轻轻的震动，室温孵化40 min，超纯水洗去未吸附的HRP；

5）光化学反应：新鲜配制2 mmol/L H2O2溶液和1.0 mg/mL OPDA避光保存，二者等体积混合，每孔加入100 μL，避光37℃恒温10 min，测定荧光强度，激发波长为468 nm，最大发射波长567nm 处的荧光强度作为定量分析的依据。

应用例1

一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器的应用，具体步骤如下：

将实施例1步骤(1), (2) 制备流感病毒H1N1印迹膜，于稀释20倍的胎牛血清溶液中，添加一定浓度的流感病毒H1N1，使流感病毒终浓度为1.0 μg/mL，加入30 μL于96孔板的印迹膜上，孵化60 min，超纯水洗3遍，按照实施例1步骤(4)，(5)进行HRP标记和光化学反应及荧光检测，同时做血清样品的空白对照，并计算添加回收率，结果如表1所示。而图1为所构建荧光传感器识别不同浓度流感病毒H1N1的荧光光谱图，图中箭头表示，流感病毒浓度由下往上：0，0.01，0.1，0.25，0.5，0.75，1.0，2.0 μg/mL；图 2为所构建荧光传感器识别不同浓度流感病毒H1N1的吸附等温线，激发波长：468 nm，发射波长：567 nm。

表1 血清样品的测定及添加回收实验