本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，是一种改良的植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法。
背景技术：
糖是植物体内一类重要有机物，对植物生长发育与形态建成具有重要作用。糖不仅作为呼吸底物为植物的生长发育提供能量，而且还作为代谢中间产物合成植物细胞结构物质的碳架等。同时糖还植物体内重要的信号分子，对基因的表达也起到调控作用。可溶性糖指易溶于水的糖，常见的如葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，与植物的抗逆性(如抗旱性、抗寒性等)密切相关。同时，可溶性糖还影响到植物食用组织或器官的品质与口感。因此，植物组织中可溶性糖含量测定是一项常规测定指标，建立快速准确的检测方法对于科研和生产具有重要意义。
蒽酮硫酸比色法是测定植物组织可溶性糖含量的常用方法，其原理是糖在浓硫酸作用下，脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮反应，生成蓝绿色化合物，在一定的范围内，颜色深浅与糖的含量成正比。蒽酮法测定可溶性糖因其准确性高、重现性好、操作简便、快速、灵敏等优点而被广泛应用于各种植物组织中可溶性糖含量的测定。尽管一些文献报道对蒽酮比色法测定可溶性糖的方法进行了优化(参考文献：丁雪梅,张晓君,赵云,等.蒽酮比色法测定可溶性糖含量的试验方法改进[j].黑龙江畜牧兽医,2014(23):230-233；位杰,吴翠云,蒋媛,等.蒽酮法测定红枣可溶性糖含量条件的优化[j].食品科学,2014,35(24):136-140；)，但在实际应用中仍然存在一些需要改进之处，如样品需要烘干测定，粉碎和提取反应时间较长，反应试剂用量较多，采用常规比色皿测定需要样品体积较多、一次测定样品数目非常有限等问题，急需建立一种针对植物鲜叶的，优化样品处理流程，快速微量测定植物中的可溶性糖含量的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种针对植物新鲜叶片，直接微量取样，简单提取后采用酶标板快速测定方法，适合于针对大批量材料采用高通量的筛选。
本发明的第一方面，提供一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：
a)取植物新鲜叶片10-100mg，装入离心管中；
b)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；
c)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；
d)放入沸水浴(100℃)加热10min；
e)取出离心管，10000rpm离心3min；
f)吸取上清溶液50μl到另一离心管中；
g)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，混匀；
h)放入沸水浴(100℃)加热；
i)取出离心管，冷却10min；
j)取显色液采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(a)；
k)取葡萄糖标准溶液，采用步骤g-j，进行显色反应，测定吸光度(a)，以吸光度a为纵坐标，以糖含量c为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数r；
l)由标准线性方程求出测定糖量(μg)，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：
进一步的，所述的方法适用于大多数植物，优选自大麦、小麦、水稻、玉米、拟南芥、油菜等作物以及枸杞、石斛等药用植物等，测定材料选用新鲜叶片。
进一步的，所述的植物新鲜叶片一般优选倒二叶或倒三叶叶尖部分；更优选倒三叶顶部。
进一步的，所述的步骤a和步骤f中离心管为2.0ml微量离心管。
进一步的，所述的步骤h中加热时间为7min。
进一步的，所述的步骤i中放在湿冰上冷却。
进一步的，所述的步骤k的具体步骤为：称取干燥后葡萄糖标准品溶于超纯水，配制500μg/ml标准品母液，吸取相应体积母液配制10-200μg的总体积为500μl的不同浓度的葡萄糖标准溶液，同上步骤g-j，加入蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，进行显色反应，测定吸光度(a)，以吸光度a为纵坐标，以糖含量c为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数r(r至少含2个9)。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明的一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：
a)剪取植物叶片(一般优选倒二叶或倒三叶叶尖部分)，称量10-100mg，装入2.0ml离心管中；
b)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；
c)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；
d)放入沸水浴(100℃)加热10min；
e)取出离心管，10000rpm离心3min；
f)小心吸取上清溶液50μl到另一干净的2.0ml离心管中；
g)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，混匀；
h)放入沸水浴(100℃)加热7min；
i)取出离心管，放在湿冰上冷却10min；
j)取100μl显色液置于96孔透明板中，采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(a)；
k)称取干燥后葡萄糖标准品溶于超纯水，配制500μg/ml标准品母液，吸取相应体积母液配制10-200μg的总体积为500μl的不同浓度的葡萄糖标准溶液，同上步骤g-j，加入蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，进行显色反应，测定吸光度(a)，以吸光度a为纵坐标，以糖含量c为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数r(r至少含2个9)；
l)由标准线性方程求出测定糖量(μg)，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：
本发明优点和有益效果在于：
1、本发明提供了一种适合大麦等植物新鲜叶片组织可溶性糖含量的快速测定方法，不需要烘干过程，采用液氮速冻后研磨粉碎，大大节约了样品处理时间；
2、本发明建立了一套优化的微量离心管处理样品、酶标板测定的微量测定体系，大大节省了蒽酮、浓硫酸等化学试剂的用量，该方法可以配合移液工作站使用，实现高通量检测方法；
3、本发明建立了一套基于植物新鲜组织微量样品的测定方法，为植物活体叶片中可溶性糖含量的时空分布规律研究提供了简便有效的评估手段，为植物的耐逆性研究和品质改良提供有用线索。
附图说明
图1不同显色反应温度对葡萄糖标液(200μg)测定吸光度的影响；
图2不同显色反应时间对葡萄糖标液(200μg)测定吸光度的影响；
图3大麦鲜叶和干粉(约100mg)不同提取时间测定可溶性糖含量比较；
图4葡萄糖标准溶液系列浓度测定线性范围与计算线性方程；
图5大麦幼苗(4-5叶期)分叶片部位取样示意图；
图6大麦幼苗不同部位取样测定可溶性糖含量结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明的一种改良经典蒽酮-硫酸比色法快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：
a)剪取植物叶片(一般优选倒二叶或倒三叶叶尖部分)，称量10-100mg，装入2.0ml离心管中；
b)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；
c)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀
d)放入沸水浴(100℃)加热10min
e)取出离心管，10000rpm离心3min
f)小心吸取上清溶液50μl到另一干净的2.0ml离心管中
g)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，混匀
h)放入沸水浴(100℃)加热7min
i)取出离心管，放在湿冰上冷却10min
j)取100μl显色液置于96孔透明板中，采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(a)
k)称取干燥后葡萄糖标准品溶于超纯水，配制500μg/ml标准品母液，吸取相应体积母液配制10-200μg的总体积为500μl的不同浓度的葡萄糖标准溶液，同上步骤g-j，加入蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm3)1000μl，进行显色反应，测定吸光度(a)，以吸光度a为纵坐标，以糖含量c为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数r(r至少含2个9)
l)由标准线性方程求出测定糖量(μg)，按下式计算原样品中的可溶性糖含量：
实施例2
本发明的一种针对经典蒽酮硫酸比色法采用微量离心管进行显色反应的优化体系，包括以下步骤
1)显色反应温度的优化：准确吸取400μl葡萄糖标准溶液(0.5μg/μl)于2.0ml离心管中，加入100μl超纯水，混匀后，依次加入100μl蒽酮乙酸乙酯溶液(20mg/ml)和1000μl浓硫酸(比重1.84)，盖紧后充分混匀后，置于不同温度包括16℃(室温)、25℃(水浴)、80℃(水浴)、100℃(水浴)进行显色反应，每个温度设置复管，加热计时10min，取出试管架置于湿冰水浴中迅速冷却至室温，10min后取出，置于96孔透明板(corning，cat#9018)中，使用thermofc多功能酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(a)，结果表明水浴温度采用100℃时测定吸光度最高(见图1)，因此显色反应温度采用沸水浴(100℃)。
2)显色反应时间优化：准确吸取400μl葡萄糖标准溶液(0.5μg/μl)于2.0ml离心管中，加入100μl超纯水，混匀后，依次加入100μl蒽酮乙酸乙酯溶液(20mg/ml)和1000μl浓硫酸(比重1.84)，盖紧后充分混匀后置于沸水浴(100℃)，采用5min、10min、15min、20min、25min显色反应，每个时间点设置复管，同上测定620nm波长下测定其吸光度(a)结果表明采用5min显色反应测定吸光度最高(图2a)；对显色反应时间进一步优化，进一步补充实验采用1min、3min、5min、7min、9min比较，结果表明采用7min显色反应测定吸光度最高，因此显色反应时间确定为7min(图2b)。
3)显色反应所使用的蒽酮和浓硫酸用量优化：采用正交实验设计对显色反应所使用的蒽酮和浓硫酸用量进行了优化，其中蒽酮(20mg/ml)体积采用四个水平(10μl，50μl、100μl、150μl)和浓硫酸(比重1.84)体积采用三个水平(100μl，500μl、1000μl)，正交试验结果表明100μl蒽酮和1000μl浓硫酸显色反应获得吸光度a最高(表1-1)，进一步补充实验采用100μl蒽酮和浓硫酸体积采用五个水平(500μl、1000μl，1500μl、2000μl、3000μl)组合比较，结果表明100μl蒽酮和1000μl浓硫酸显色反应获得吸光度a最高(表1-2)，因此蒽酮和浓硫酸显色反应体系确定为100μl蒽酮(20mg/ml)和1000μl浓硫酸(比重1.84)；高浓度或低浓度都会造成显色反应不充分。
表1-1采用正交设计不同蒽酮-浓硫酸反应体系的吸光度结果
表1-2不同蒽酮-浓硫酸反应体系优化的吸光度结果
4)样品可溶性糖提取时间优化：取大田生长的大麦幼嫩叶片(4-5叶期)，剪碎后称取约100mg，放入2.0ml离心管中；同时称取大麦茎叶干粉约100mg，放入2.0ml离心管中。加入少许液氮，用小研磨棒迅速研磨成碎片，加入1000μl超纯水，采用沸水浴(100℃)提取不同时间(10min、20min、30min、40min、50min、60min)，每个时间点设置复管，结果表明无论干粉或鲜样，该物料比体系10min提取可溶性糖含量和其他更长时间提取率不存在显著差异(图3)，因此采用10min提取时间即可。
5)标曲线性范围考察：按下表2分别配制5-200μg的葡萄糖标准溶液，100μl蒽酮(20mg/ml)和1000μl浓硫酸(比重1.84)，盖紧后充分混匀后置于沸水浴(100℃)，加热计时7min，取出试管架置于湿冰水浴中迅速冷却至10min后取出，置于96孔透明板(corning，cat#9018)中，使用thermofc多功能酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(a)，以糖含量c为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数r。结果表明，5μg的葡萄糖标准溶液的吸光度(0.087)与酶标板的背景值(0.051)比较接近，应当舍弃，其余浓度范围(10-200μg)的吸光度(0.1-1.6)线性范围良好，相关系数r＝0.9991(图4)。
表2
6)大麦鲜叶中可溶性糖测定精密度实验：取同一大麦鲜叶可溶性糖提取液5份，同时显色反应，测定测定其吸光度(a)，并根据标准曲线计算样品可溶性糖含量，计算获得5次测定值的相对标准偏差(relativestandarddeviation；rsd)小于3％(表3)。
表3同一大麦鲜叶提取液5次独立重复测定结果
7)大麦鲜叶中可溶性糖测定稳定性实验：取同一大麦品种鲜叶可溶性糖提取液10份，同时显色反应，测定测定其吸光度(a)，并根据标准曲线计算样品可溶性糖含量，室温(16℃)不同放置时间(0min、20min、30min、40min、60min和120min)测定的样品可溶性糖含量，计算获得6次重复测定值的相对标准偏差(relativestandarddeviation；rsd)小于3％(表4)
表4同一测定样品溶液放置不同时间后的测定稳定性结果
8)大麦幼苗鲜叶取样部位的选择优化实验：取同一大麦品种(“花30”)大田生长幼苗(4-5叶期，图5)的顶叶(完全展开叶)、倒二叶、倒三叶和茎段中可溶性糖含量，另外将倒二叶和倒三叶按叶长顺序平均分为三段，测定同一叶片不同部位可溶性糖含量，结果表明，幼苗不同部位可溶性糖含量依次为：倒三叶>倒二叶>顶叶>茎段；倒三叶、倒二叶不同部位可溶性糖含量依次为：顶部>中部>基部(图6)。
综上所述，本发明提供了一种针对植物新鲜叶片采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性糖含量的快速微量方法，包括：1)植物新鲜叶片取样10-100mg直接提取测定；2)置于微量离心管(2.0ml)，加入少许液氮小研磨棒快速研磨粉碎；3)优化了显色反应温度(100℃)、反应时间(7min)、蒽酮(100μl)-浓硫酸(1000μl)反应体系；4)考察了测定方法的线性范围(10-200μg葡萄糖标液线性良好)、精密度(小于3％)和稳定性(120min内稳定)；5)考察了不同叶片来源和不同叶片部位的可溶性糖含量差异，确定叶片鲜样取样部位为倒三叶顶部。本发明改进方法与已报道方法的改进优化效果比较见表5。
表5本发明改进方法与已报道方法的比较
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。