本发明涉及电化学分析技术领域，具体是一种生物硫醇电化学传感器及其制备方法与应用。
背景技术：
半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等生物硫醇是一类在生物体内发挥重要生理作用的巯基化合物，在维持细胞内氧化还原平衡、信号传导、基因调控等诸多生理过程中扮演了重要角色。生物体内硫醇浓度的不正常的表达与很多疾病相关。例如半胱氨酸的缺乏会导致各种健康问题，如生长迟缓、毛发色素脱失、嗜睡、肝脏和皮肤组织损伤以及脂肪损失等。因此，硫醇含量的检测对许多疾病的诊断有着重要意义。
目前已报道的生物硫醇的检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光检测、质谱法等。高效液相色谱法和质谱法仪器成本高，且需要专业人员操作。而光谱法又受生物硫醇在紫外可见光谱区的摩尔吸光系数低、自身又无荧光的限制，通常需要通过巯基衍生化处理或借助与荧光探针的相互作用进行各种光谱法测定。电化学分析技术具有灵敏度高、分析速度快、操作简单、价格便宜且易于微型化、可实现在线活体分析等优点。半胱氨酸等生物硫醇直接电氧化信号可以产生微弱的氧化电流，且过电位高，文献中的生物硫醇电化学检测方法多是借助各种纳米材料与功能物质修饰电极在研究生物硫醇电催化氧化的基础上提高其检测灵敏度。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题，提供一种生物硫醇电化学传感器，所述电化学传感器具有制备简单、响应迅速、选择性和灵敏度高的优点。
本发明的另一目的在于提供一种上述生物硫醇电化学传感器的其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：
一种生物硫醇电化学传感器，包括工作电极、参比电极、对电极和支持电解质溶液；所述工作电极为在基体电极表面修饰金纳米簇制得，所述支持电解质溶液中含有电化学探针，所述金纳米簇的保护剂为芳基硫醇。
优选的，所述基体电极为玻碳电极；所述电化学探针为铁氰化钾。
优选的，所述芳基硫醇为苯乙硫醇、甲苯硫醇或氨基苯硫醇。
一种上述生物硫醇电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)对基体电极进行抛光处理；
(2)将金纳米簇溶液滴涂在抛光后的基体电极表面，晾干；
(3)将步骤(2)得到的电极循环伏安扫描直至得到稳定的曲线。
优选的，所述步骤(1)中采用0.05μm的al2o3粉末对基体电极进行抛光处理后，在超纯水中超声处理1分钟，室温下干燥。
优选的，所述基体电极为玻碳电极。
优选的，步骤(2)中所述金纳米簇溶液的制备方法是：
1)将溶有四辛基氯化铵的二氯甲烷与25mmol/l的氯金酸溶液混合，搅拌15分钟后移去水相，置于冰浴中冷却；
2)往步骤1)所得溶液中加入芳基硫醇后搅拌至溶液呈无色透明状；
3)往步骤2)所得无色透明溶液中加入nabh4溶液，反应4h后，在室温下搅拌6～7h后在4℃下老化过夜。
优选的，步骤2)中所述芳基硫醇为苯乙硫醇、甲苯硫醇或氨基苯硫醇。
所述生物硫醇电化学传感器在生物硫醇电化学检测中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供的生物硫醇电化学传感器以芳基硫醇保护的金纳米簇修饰的基体电极为工作电极，利用生物硫醇与电极表面修饰的金纳米簇的保护剂芳基硫醇之间的配体交换，引起电极表面的界面阻抗减小，借助电化学探针的氧化还原电流的增加，实现生物硫醇的定量检测，该传感器仅对溶液中的半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱氨肽等生物硫醇响应，对其他氨基酸和含硫阴离子无响应，具有高的选择性；由于生物硫醇与金纳米簇的保护剂芳基硫醇之间的配体交换反应迅速且对界面阻抗的影响显著，使得本发明所述生物硫醇电化学传感器响应迅速且检出限低，可达5×10-8mol·l-1，能够用于血清、尿样等样品中生物硫醇的检测。
附图说明
图1.本发明所述金纳米簇的紫外可见光谱图；
图2.本发明所述金纳米簇的透射电镜图；
图3.本发明所述金纳米簇的x射线衍射图；
图4.本发明所述金纳米簇的电化学行为图；
图5.本发明所述金纳米簇修饰的电极在铁氰化钾溶液中的循环伏安图；
图6.本发明所述金纳米簇修饰的电极的电化学阻抗图；
图7.本发明所述电化学传感器对半胱氨酸的循环伏安响应图；
图8.本发明所述电化学传感器对应于半胱氨酸响应的微分脉冲伏安图及相应的峰电流与浓度的关系图；
图9.本发明所述电化学传感器对应于同型半胱氨酸响应的微分脉冲伏安图及相应的峰电流与浓度的关系图；
图10.本发明所述电化学传感器对应于谷胱甘肽响应的微分脉冲伏安图及相应的峰电流与浓度的关系图；
图11.本发明所述电化学传感器对12种常见氨基酸和3种生物硫醇的响应对比柱状图；
图12.本发明所述电化学传感器随着半胱氨酸浓度变化的界面阻抗图；
图13.本发明所述电化学传感器在半胱氨酸溶液中浸泡过后的表面能谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述生物硫醇电化学传感器以芳基硫醇保护的金纳米簇修饰的基体电极为工作电极，利用生物硫醇与电极表面修饰的金纳米簇的保护剂芳基硫醇之间的配体交换，由于生物硫醇保护的金纳米簇对电子传递的抑制作用减弱，引起电极表面的界面阻抗减小，使电化学探针的峰电流逐渐增大，实现生物硫醇的定量检测，该传感器仅对溶液中的半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱氨肽等生物硫醇响应，对其他氨基酸和含硫阴离子无响应，具有高的选择性。
实施例
1.苯乙硫醇保护的金纳米簇的制备：
将0.256g相转移剂四辛基氯化铵溶于10ml二氯甲烷中，与16ml25mmol/l的氯金酸溶液混合，搅拌15分钟后移去水相，用冰浴将含四氯金酸离子的二氯甲烷溶液冷却至约0℃，加入145μl苯乙硫醇，搅拌至溶液转变为无色透明状后，迅速加入7ml0.57mol/l的用冰水新鲜配制的nabh4溶液，反应4h后撤去冰浴，再在室温下搅拌6～7h后在4℃下老化过夜。
2.生物硫醇电化学传感器的制备：
将直径为3mm的玻碳电极用0.05μm的al2o3粉末进行抛光处理后，在铁氰化钾溶液中扫描循环伏安曲线，直至其氧化还原峰值差在70mv以下，然后在超纯水中超声处理1分钟，室温下干燥。将所制备的金纳米簇溶液小心地滴加在电极表面，置于通风处中晾干，然后将电极置于铁氰化钾溶液中循环伏安扫描直至得到稳定的曲线；
支持电解质为0.1mol/l的kcl溶液，其中铁氰化钾的浓度为5mmol/l，参比和对电极分别采用饱和甘汞电极和铂电极，扫描范围为–0.2～0.6v，所述玻碳电极的表观面积约为0.071cm2。
3.所述生物硫醇电化学传感器在生物硫醇检测中的应用：
分别以芳基硫醇保护的金纳米簇修饰的基体电极、饱和甘汞电极和铂电极为工作电极、参比电极和对电极，组成三电极体系，接入电化学工作站，支持电解质为0.1mol/l的kcl溶液，其中所含电化学探针铁氰化钾的浓度为5mmol/l，向其中加入含有生物硫醇的溶液或样品后记录微分脉冲伏安图，所述微分脉冲伏安图的测量设定脉冲宽度0.02s，脉冲高度0.04v，脉冲周期0.1s。电位范围为–0.2～0.5v。
测试例
1.本发明所述金纳米簇的表征：
图1所示为金纳米簇的紫外可见光谱图，由图中可观察到两个以～445和～716nm为中心的弱吸收带，未观察到常规金纳米粒子的典型等离子体共振峰(～520nm)，说明本发明所制备的纳米粒子并非粒径>5nm的大尺寸金纳米粒子或具有较大au原子个数的金纳米簇(如au329)。该光谱与au25、au38、au67等原子个数较少的金纳米簇的光谱也不同，而与原子个数在70～150范围内的金纳米簇的紫外可见光谱相似，因此，紫外可见吸收光谱表明所制备的金纳米簇的金原子数为70～150。
图2为所制备的金纳米簇的透射电子显微图像，由图可见本发明所制备的金纳米簇的粒径均匀，平均直径为2.5nm。
图3为棒状金纳米粒子和所制备的金纳米簇的粉末x射线衍射图，由图可见：棒状金纳米粒子的x射线衍射图在37.4°、44.4°、64.6°和77.6°等不同2θ角度出现了金晶体的面心立方晶胞特征衍射图样，而所制备的金纳米簇的x射线衍射图上仅有两个非常宽角度范围的衍射峰，峰中心角度分别是37.7°和64.6°，这与au25、au67和au99等金纳米簇的粉末衍射图类似，进一步表明了所制备的金纳米簇具有超小的尺寸。
图4为所制备的金纳米簇在含有0.05mol/l四丁基六氟磷酸铵的二氯甲烷溶液中的微分脉冲伏安图，由图可见：正扫与反扫伏安图上出现了5对氧化还原峰，这是超小纳米粒子的典型量子化双电层充放电峰，每一个峰对应一个单电子或电洞的充放电过程，根据氧化态第一个峰与还原态第一个峰之间的峰电位差值，估算出该纳米簇的金原子个数约为128。
2.金纳米簇修饰的电极：
图5为本发明所述金纳米簇修饰的电极在铁氰化钾溶液中的循环伏安图，由图可见：与裸金电极的循环伏安图相比，金纳米簇修饰的电极的循环伏安图中的阳极和阴极峰电流都显著减小，并且随着金纳米簇修饰量的增加，峰电流减小的幅度更为明显，说明修饰的金纳米簇对电极表面的电子传递有抑制作用，这与常规金纳米粒子不同，后者往往会增强电极表面的电子传递。
图6为裸电极与金纳米簇修饰的电极的电化学阻抗图，阻抗图谱包括一个高频的半圆部分和一个低频的直线部分，界面阻抗可通过半圆部分的直径得到，半圆的直径越大表明所对应电子传递的阻力越大，由图可见：与裸电极相比，金纳米簇修饰的电极的界面阻抗明显增加，进一步说明所修饰的金纳米簇对电极表面的电子传递过程有阻碍作用。
图7为金纳米簇修饰的电极在含有半胱氨酸和铁氰化钾的0.1mol/lkcl溶液中的循环伏安图，图中a-d分别为电极表面金纳米簇修饰量为0、0.5、3和5μl的响应，由图a可见，半胱氨酸的加入并未对铁氰化钾的循环伏安图造成任何影响，说明半胱氨酸与铁氰化钾之间不存在反应或在电极表面的竞争吸附等问题。而对于金纳米簇修饰的电极，半胱氨酸加入后，铁氰化钾的氧化还原峰电流均有不同程度的增加，并且修饰量为0.5μl时峰电流改变幅度较小；修饰量为5μl时峰电流改变幅度最大，说明半胱氨酸与修饰在电极表面的金纳米簇之间有相互作用，而且，峰电流的改变与半胱氨酸的浓度之间有定量相关性。据此，可建立基于金纳米簇的“signal-on”型生物硫醇电化学检测新方法。
3.所述电化学传感器对生物硫醇的检测：
图8为以3μl金纳米簇修饰玻碳电极制备的传感器在含有5mmol/l铁氰化钾的0.1mol/lkcl溶液中，对不同浓度半胱氨酸的微分脉冲伏安响应，由图可见随着半胱氨酸浓度的增加，铁氰化钾在金纳米簇修饰的电极上的微分脉冲伏安峰增加；图b给出了峰电流与半胱氨酸浓度的关系，铁氰化钾的峰电流与半胱氨酸浓度的二分之一次方呈良好的线性关系，线性范围为：1.0×10-7mol·l-1～2.0×10-4mol·l-1，检出限为5×10-8mol·l-1。
图9和图10分别为传感器对高半胱氨酸和谷胱甘肽的微分脉冲伏安响应，其检出限均可达到5×10-8mol·l-1。
图11为所述电化学传感器对生物硫醇(半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽)与其他11种氨基酸的微分脉冲伏安响应上峰电流的对比图，黑色柱图为金纳米簇修饰的电极在铁氰化钾溶液中的氧化峰电流，而红色柱图为加入考察物质后的峰电流，由图可见，组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等氨基酸的加入对峰电流并无明显影响，而生物硫醇的加入则使峰电流明显增加，说明金纳米簇修饰的电极只选择性地响应硫醇类物质。
此外，抗坏血酸、葡萄糖和乳糖等体液中潜在的干扰物质和so32-、s2o32-、so42-和scn-等含硫阴离子也基本不影响对该传感器的响应；co2+、ni2+、cu2+、pb2+、mg2+和nh4+等阳离子以及no3-、no2-、cl-、ch3coo-等阴离子对生物硫醇的检测也基本没有影响，说明该传感器对生物硫醇的检测具有很好的选择性。
图12为金纳米簇修饰的电极的电化学阻抗谱图，由图可见，随着半胱氨酸的加入，金纳米簇修饰的电极的表面电阻逐渐减小，表明半胱氨酸改变了金纳米簇的导电性，生物硫醇保护的金纳米簇对电子传递的抑制作用减弱，使电化学探针铁氰化钾的峰电流逐渐增大。
图13为将金纳米簇修饰的电极浸入半胱氨酸溶液一段时间后所得修饰电极的能谱图，从中检测到了n和o元素，结合保护剂苯乙硫醇与半胱氨酸的结构式，进一步证实了上述生物硫醇与电极表面修饰的金纳米簇的保护剂芳基硫醇之间的配体交换，引起电极表面的界面阻抗减小，使电化学探针的峰电流逐渐增大，实现生物硫醇的定量检测的生物硫醇检测原理。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。