一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法与流程

技术特征：

1.一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺；所述的探针的化学结构式为：

2.如权利要求1所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺是；是用探针和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺分别对活细胞进行孵化，使探针和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺先后分别进入细胞内，在细胞内结合生成探针-Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺配合物导致探针发出的荧光猝灭，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活细胞荧光像，具体方法为：

(1)活性Hela细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗RPMI 1640的培养基中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次；

(2)将步骤(1)中清洗后的Hela细胞浸入含25μM探针的培养液中，培养液的组成为98％培养基和2％N,N-二甲基甲酰胺，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱内孵育90min，吸出含探针的培养液，用新鲜的RPMI Medium Modified培养基清洗细胞三次，置于荧光倒置显微镜下分别进行场亮场和暗场拍照；荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探染色后细胞的荧光图像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞呈现的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像；

(3)在上述(2)中细胞孔板内再分别加入0.5mL含60μM Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液，培养液的组成为98％培养基和2％H2O，在恒温培养箱内孵育40min，进行细胞内探针对Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色，吸出含Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液，用新鲜的RPMI Medium Modified培养基洗三次，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色后的荧光像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞的绿色荧光猝灭，表明探针能在活性Hale细胞中检测微量Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子。

3.如权利要求2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所用活体Hale细胞是人体宫颈癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

4.如权利要求1或2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的探针；是按下述合成路线合成的：

5.如权利要求1或2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的探针；是按下述步骤进行制备：

①中间体1的制备：

取对叔丁基苯酚，加入1000ml的三口圆底烧瓶中，然后按照对叔丁基苯酚:氢氧化钠:37％甲醛水溶液为0.67mol:33.75mmol:80ml的比例依次向对叔丁基苯酚中加入氢氧化钠以及37％甲醛水溶液，在氮气流下吹出90％以上的水，加热到110-120℃，机械搅拌1.5-2.5h后，停止反应，冷却至室温，按37％甲醛水溶液与二苯醚为80:500的体积比向其中倒入85℃的二苯醚，并继续搅拌，将烧瓶中的混合物加热回流，反应2.5-3.5h后，停止反应，冷却至室温，按二苯醚与乙酸乙酯为500:2000的体积比向烧瓶中加入乙酸乙酯，搅拌至白色沉淀析出，静置，抽滤，并依次用乙酸乙酯、乙酸和蒸馏水洗涤3次，干燥，即得白色粉末中间体1；

②中间体2的制备：

中间体1放入250ml圆底烧瓶中，按中间体1:甲苯:苯酚:无水AlCl3为30.87mmol:150ml:154.3mmol:185.2mmol的比例依次向圆底烧瓶中加入甲苯:苯酚:无水AlCl3，氮气保护下室温搅拌，反应3.5-4.5h后，将反应液倒入1M盐酸水溶液中，依次用盐酸溶液和水洗涤，分液，并蒸发掉溶剂，按甲苯与甲醇为1:1的体积比向所得固体中加入甲醇回流25-35min，冷却抽滤，得到中间体2；

③中间体3的制备：

乙腈加入三口烧瓶中，按乙腈:中间体2:K2CO3为150ml:11.8mmol:12.92mmol的比例向装有乙腈的三口烧瓶中依次加入中间体2和K2CO3，搅拌加热回流25-35min后，按乙腈:溴乙酸乙酯为150:6的体积比向烧瓶中加入溴乙酸乙酯，搅拌加热回流17-19h，反应混合物抽滤，滤液旋干，得到固体，用二氯甲烷溶解，用10％的盐酸洗两次，水洗涤两次，分液，有机层用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用氯仿溶解，再加入甲醇，重结晶得到无色固体中间体3；

④中间体4的制备：

在三口瓶中加入中间体3，按中间体3:干氯仿为1.23mmol:30ml的比例向三口瓶中加入干氯仿，室温搅拌下，按中间体3:Cl2CH2OCH3:TiCl4为1.23mmol:25.42mmol:49.24mmol的比例依次加入Cl2CH2OCH3和TiCl4，室温氮气氛围中反应18-20h，反应毕，将溶液倒入装有冰的5％盐酸溶液烧杯中，残留在壁上的黑色固体用5％盐酸洗涤两次均倒入烧杯，搅拌，分层，分液，有机相用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，固体经硅胶柱分离，洗脱液是体积比为2:1的石油醚:乙酸乙酯，得无色固体中间体4；

⑤探针的制备

按中间体4:碘化氮甲基四甲基吡啶:甲醇:氯仿为1.56mmol:2.80mmol:40ml:10ml的比例将中间体4、碘化氮甲基四甲基吡啶、甲醇、氯仿置于三口瓶中，氮气保护回流8-12min后，按甲醇与哌啶的体积比为40:0.3滴入哌啶回流2.5-3.5h，冷却室温，抽滤，固体分别用乙醚，

甲醇，丙酮洗涤，得黄色固体，用丙酮重结晶，最后抽滤烘干得探针化合物。