本发明涉及一种利用氯吡脲对牛血清蛋白(BSA)荧光的淬灭作用结合二维相关光谱和BP神经网络检测猕猴桃中氯吡脲的方法，属于食品检测方法领域。
背景技术：
猕猴桃风味独特，口感鲜美，富含维生素C、膳食纤维和多种矿物营养，并具有诸多保健功效，是当今世界备受青睐的重要水果之一。随着人们对猕猴桃深入了解和全球商业化开发的兴起，中国猕猴桃产业得到了迅速发展，栽培面积和产量均居世界第一。由于氯吡脲的生长促进作用效果优异，尤其是能促进果实膨大，因而被应用于猕猴桃上。但是猕猴桃生长过程中氯吡脲的滥用，严重影响猕猴桃的内在品质，阻碍猕猴桃产业的发展。猕猴桃生产过程中，农民一味追求产量，超剂量使用氯吡脲，果实一般增大50％左右，果实纵径变短，果蒂变宽或突出，果心变粗变空，果实生理后熟变快，货架期、贮藏期变短，很快后熟变软腐烂。研究表明，长期接触氯吡脲会引起体内蛋白质代谢紊乱、轻度肺气肿和体形消瘦，尤其对儿童和老人影响较大，长期接触也会引起体内蛋白质代谢的紊乱、肺气肿和体形消瘦。
现有的检测方法，虽然技术上成熟、精度高，但技术条件要求高、样品预处理过程复杂、耗时、检测费用高、在检测过程中需要用到大量化学试剂,易造成环境污染,难以进行现场快速、绿色检测，不适合猕猴桃中氯吡脲残留的常规检测。因此迫切需要寻找一种具有快速、准确、方便、经济、安全、低成本等特点的方法来检测猕猴桃中氯吡脲含量，以适合我国国情，满足猕猴桃生产的实际需要，推进猕猴桃产业持续健康发展。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服当前检测方法的不足，提供一种利用氯吡脲对BSA荧光的淬灭作用结合二维相关光谱和BP神经网络检测猕猴桃中氯吡脲的方法。
本发明是按照以下技术方案实现的:
一种利用荧光淬灭作用检测猕猴桃中氯吡脲的方法，由以下步骤组成：
(1)称取待检猕猴桃样品以乙酸乙酯为提取剂，按照常规预处理方法进行处理，得到待检样品提取液；
(2)将步骤(1)所得待检样品提取液加入浓度为1.5×10-5mol/L的牛血清白蛋白溶液中，采集待检样品的淬灭荧光发射光谱；采集参数：激发和发射单色仪狭缝宽度均为3.0～10.0nm，扫描速度为200～2000nm/min，激发波长为250～290nm；在200～900nm范围内测量样品的荧光淬灭光谱，扫描间隔为0.5～2.0nm；
(3)对步骤(2)的淬灭荧光发射光谱数据进行二阶导数处理，得待测样品的导数光谱数据；
(4)将氯吡脲含量为0的猕猴桃标准样品按照上述步骤(1)～(3)的方法处理，得到标准样品的导数光谱数据；
(5)将步骤(4)所得标准样品的导数光谱数据与步骤(3)所得的待测样品导数光谱数据按照行排列组成光谱矩阵；
(6)按下式计算同步二维荧光光谱强度矩阵：
Φ＝STS
式中Φ为同步二维荧光光谱强度矩阵；S为步骤(5)组成的光谱矩阵，是由2行光谱数据组成，第1行光谱数据为标准样品的导数光谱数据，第2行光谱数据为待测样品的导数光谱数据；
(7)将步骤(6)所得的同步二维荧光光谱强度矩阵中主对角线301～399cm-1范围对应的数据提出，并代入已经训练好的BP神经网络模型，得到待测样品中氯吡脲的含量。
进一步限定，所述步骤(1)的预处理方法为：称取猕猴桃样品，打浆，以乙酸乙酯为提取剂，超声震荡10～30min，加入无水MgSO4和NaCl,旋涡,静置，放入离心机中设定5000r/min离心10min，取上清液得到待检样品提取液。
进一步限定，所述1.5×10-5mol/L的牛血清白蛋白溶液配制方法为：准确称取牛血清白蛋白于比色管中，用浓度为0.05mol/L、PH＝7.40的Tris-HCl缓冲溶液溶解，放入超声波中进行混匀。
进一步限定，步骤(2)中利用荧光光谱法采集待检样品的淬灭荧光发射光谱的参数为：激发和发射单色仪狭缝宽度均为5nm，扫描速度为1000nm/min，激发波长为280nm；在285～459nm范围内测量每个样品的荧光淬灭光谱，扫描间隔为1nm。
进一步限定，所述步骤(3)中的二阶导数处理采用Orign8.0软件进行处理。
进一步限定，所述步骤(7)中的BP神经网络模型是采用Matlab软件NNTOOL库进行BP神经网络模型的训练。
进一步限定，所述BP神经网络模型的具体训练方法为：采集N个含有不同浓度氯吡脲的猕猴桃样品，每个样品分成两部分，一部分按步骤(1)～(7)进行处理，得到的数据作为输入数据集，另一部分依据SN/T3643-2013方法测定氯吡脲含量，得到的数据作为输出数据集，选择部分组数据作为训练集，用于训练BP神经网络，将剩余组数据作为模型测试集，用于测试所建立BP神经网络模型识别精度，进而完成BP神经网络模型的训练。
本发明的利用荧光淬灭作用检测猕猴桃中氯吡脲的方法是利用荧光淬灭作用结合二维相关光谱和神经网络模型实现猕猴桃中氯吡脲的检测，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明利用氯吡脲对牛血清蛋白荧光的淬灭作用结合二维相关光谱和神经网络检测猕猴桃中氯吡脲的方法，检测更为准确、快速，可广泛应用于猕猴桃中氯吡脲含量的检测。
2、本发明利用对荧光光谱数据进行二阶导数处理，可以消除基线漂移和平缓背景干扰的影响，采用二维相关技术将荧光光谱信号扩张到第二维上，可以区分出在一维荧光光谱上被覆盖的小峰和弱峰。两者均可提供比原光谱更高的分辨率。
3、本发明提取了同步二维荧光光谱主对角线上的数据，用于建模分析，该谱主对角线上的数据反映了随外扰变化待测体系“差异性”变化信息，提取出了猕猴桃中微量氯吡脲含量的信息。
4、本发明利用氯吡脲对BSA荧光的淬灭作用结合二维相关光谱和BP神经网络检测猕猴桃中氯吡脲的含量，提取出了猕猴桃中微量氯吡脲含量的变化信息，也克服了直接采用同步谱矩阵数据建模存在的冗余问题。该方法样品处理简单、分析效率和准确率高。
5该方法对猕猴桃中氯吡脲含量的检测限为50ug/kg,检测值与实际值的决定系数为0.96249.
附图说明
图1为12个样品的荧光淬灭光谱。
图2为12个样品的荧光淬灭光谱的二阶导数光谱。
图3为氯吡脲含量为2400ug/kg样品的二维相关同步谱。
图4为预测值与实测值的相关系数图。
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施情形。
实施例1
本实施例检测猕猴桃中氯吡脲的方法由以下步骤实现：
(1)称取8.00g的待测猕猴桃样品于50ml离心管中，打浆，加入16ml乙酸乙酯作为提取剂，超声震荡20min，加入1.2g无水MgSO4和0.8gNaCl,旋涡5min,静置30min，放入离心机中设定5000r/min离心10min，得500ml上清液，作为待检样品提取液。
(2)将步骤(1)所得待检样品提取液0.5ml加入浓度为1.5×10-5mol/L的牛血清白蛋白溶液中，采集待检样品的淬灭荧光发射光谱；荧光光谱采用日本岛津公司的RF-6000荧光分光光度计，采集参数：激发和发射单色仪狭缝宽度均为5nm，扫描速度为1000nm/min，激发波长为280nm；在285～459nm范围内测量每个样品的荧光淬灭光谱，扫描间隔为1nm。
进一步说明，淬灭荧光发射光谱的采集参数范围为：激发和发射单色仪狭缝宽度均为3.0～10.0nm，扫描速度为200～2000nm/min，激发波长为250～290nm；在200～900nm范围内测量每个样品的荧光淬灭光谱，扫描间隔为0.5～2.0nm。
进一步说明，1.5×10-5mol/L的牛血清白蛋白溶液的配制方法为：准确称取0.051gBSA于50ml比色管中，用0.05mol/L的Tris-HCl(PH＝7.40)缓冲溶液定容至10ml，放入超声波中进行混匀。
(3)采用Orign8.0软件对步骤(2)的淬灭荧光发射光谱进行二阶导数处理，可以消除基线漂移和平缓背景干扰的影响，得待测样品的导数光谱数据；
(4)将氯吡脲含量为0的猕猴桃标准样品按照上述步骤(1)～(3)的方法处理，得到标准样品的导数光谱数据；
(5)将步骤(4)所得标准样品的导数光谱数据与步骤(3)所得的待测样品导数光谱数据按照行排列组成光谱矩阵；
(6)按下式计算同步二维荧光光谱强度矩阵：
Φ＝STS
式中Φ为同步二维荧光光谱强度矩阵；S为步骤(5)组成的光谱矩阵，是由2行光谱数据组成，第1行光谱数据为标准样品的导数光谱数据，第2行光谱数据为待测样品的导数光谱数据。
(7)将步骤(6)所得的同步二维荧光光谱强度矩阵中主对角线301～399cm-1范围对应的数据提出，并代入已经训练好的BP神经网络模型，得到待测样品中氯吡脲的含量。
BP神经网络模型是采用Matlab软件NNTOOL库训练的，具体训练方法为：采集N个含有不同浓度氯吡脲的猕猴桃样品，每个样品分成两部分，一部分按步骤(1)～(7)进行处理，得到的数据作为输入数据集，另一部分依据SN/T3643-2013方法测定氯吡脲含量，得到的数据作为输出数据集，选择部分组数据作为训练集，用于训练BP神经网络，将剩余组数据作为模型测试集，用于测试所建立BP神经网络模型识别精度，进而完成BP神经网络模型的训练。
为了进一步验证本发明的检测方法的结果准确性，现通过以下实验说明。
取一定量的浓度为10-5mol/L的氯吡脲溶液，加入到相同的猕猴桃提取液中，配制氯吡脲含量分别为300μg/kg、600μg/kg、900μg/kg、1200μg/kg、1500μg/kg、1800μg/kg、2100μg/kg、2400μg/kg、2700μg/kg、3000μg/kg、3300μg/kg、3600μg/kg的12个样品作为实验样品。
用上述本发明的检测方法分别对12个实验样品的氯吡脲含量进行检测，12个样品的淬灭荧光发射光谱图参见图1，荧光淬灭光谱的二阶导数光谱图，参见图2，氯吡脲含量为2400ug/kg样品的二维相关同步谱，参见图3，结果本发明的BP神经网络模型对12个样品的预测值与实际值的相关系数见图4。
从中可以看出预测值与实际值均匀的分布在直线两侧，决定系数为0.96249，预测的效果较好，结果准确，能满足测定猕猴桃中氯吡脲含量的检测，而且检测过程具有时间快及准确度高的特点。