基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法与流程

本发明涉及基于荧光染料tht、ret基因的温度计的构建方法，基本为基于ret基因构象变化引起荧光染料tht荧光强度变化来指示温度变化的温度计的构建方法。

背景技术：

温度计，是测温仪器的总称，可以准确的判断和测量温度。通常利用固体、液体、气体受温度的影响而热胀冷缩等的现象为设计的依据。有煤油温度计、酒精温度计、水银温度计、气体温度计、电阻温度计、温差电偶温度计、辐射温度计和光测温度计、双金属温度计等多种温度计。大多是利用物质的物理性质来设计温度计用于不同的环境中。

ret蛋白是一种受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase),，一种原癌基因，对氢离子有响应，在弱酸环境里，会折叠成i-motif结构。人端粒存在富含胞嘧啶（c）的脱氧核苷酸（dna）序列，这些序列在酸性环境中能通过胞嘧啶（c）与质子化胞嘧啶ch⁺之间的氢键相互作用形成平行双链，两条双链反平行相互插入所形成的四链非共价复合物，称为结构。结构多存在于原癌基因的启动子区域，如血管内皮生长因子、原癌基因以及成视网膜细胞瘤基因等，使其成为基因调控和抗癌药物设计的靶点。

硫黄素t（tht）又称碱性黄1，2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物，分子式是c17h19cln2s，是一种化工染料。ret为发卡结构时，tht与ret结合，有荧光发射，当ret变为i-motif结构时，tht与ret分离，无荧光。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了提供一种基于荧光染料tht、ret基因的温度计的构建方法，高效灵敏、简单、快速的基于ret基因构象变化引起荧光染料tht荧光强度变化来指示温度变化的温度计的构建方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于荧光染料tht、ret基因的温度计的构建方法，按下述步骤：

第一，荧光染料tht和ret基因摩尔比为1：1，在tris-hcl缓冲溶液中培养形成体系，通过改变tris-hcl缓冲溶液的ph值，分别控制体系的ph值为7、8和9；

第二，在温度4-55℃范围内，每间隔3℃恒温培养30分钟；

第三，检测荧光，参数设置为狭缝10nm，电压500v，获得各温度梯度荧光强度参数。

本发明机理是：在弱酸性环境下，ret基因会折叠成i-motif结构，当ret基因为发卡结构时，在体系中荧光染料tht与ret基因结合，处于发卡结构的空穴区内，tht有荧光发射。

所述的基于荧光染料tht、ret基因的温度计的构建方法，在弱酸性环境下，利用ret基因会折叠成i-motif结构，ret基因在ph=7、8、9时随温度而发生构象变化的温度为tm，当ret基因为发卡结构时，荧光染料tht与ret基因结合，处于发卡结构的空穴区内，引起荧光染料tht荧光强度的变化，对温度有明显响应。

当温度升高超过其构象变化的温度时，tht荧光强度下降，推测发卡结构解开变成单链结构，此时tht与ret分离。

本发明可利用上述的构建方法设计一种基于荧光染料tht、ret基因的温度计。

另外，根据人体的ph值7左右的特性，将ph值调至7，在25-40℃，每一度恒温培养30分钟。ph值调至与人体的ph值相近，设计温度在25-40℃的体温计，检测荧光强度，对每一度均有明显响应且能区分开，重复测试三次以上，取每度荧光强度的平均值，设计成可商用的“体温计”。

而本发明主要探究了ret基因在ph=7、8、9时随温度而发生的构象变化，从而引起荧光染料tht荧光强度的变化，发现对温度有明显响应，以此设计了温度计。

本发明利用ret基因特性，与荧光染料tht在tris-hcl缓冲溶液中培养形成荧光体系，用于温度计。

附图说明

图1是ph=7时，4-55℃区间（间隔为3℃）的荧光发射曲线图；

图2是ph=7时，4-55℃区间（间隔为3℃）的线性图；

图3是ph=8时，4-50℃区间（间隔为3℃）的荧光发射曲线图；

图4是ph=8时，4-55℃区间（间隔为3℃）的线性图；

图5是ph=9时，4-55℃区间（间隔为3℃）的荧光发射曲线图；

图6是ph=9时，4-55℃区间（间隔为3℃）的线性图；

图7是ph=7时，25-40℃区间（间隔为1℃）的荧光发射曲线图；

图8是ph=7时，25-40℃区间（间隔为1℃）的线性图；

图9是ph=7时，25-40℃区间的循环图；

图10本发明原理示意图。

具体实施方式

一种基于ret构象变化的温度计的构建方法，在弱酸性环境下，ret基因会折叠成i-motif结构，当ret基因为发卡结构时，荧光染料tht与ret基因结合，处于发卡结构的空穴区内，tht有荧光发射，如下图10所示左侧的结构示意图

ret基因受温度影响会发生构象改变，当温度升高超过其构象变化的温度（tm）时，推测发卡结构解开变成单链结构，此时tht与ret分离，tht荧光下降。如下图10右侧的结构示意。

一，体系构建的准备：

1.tris-hcl缓冲液（tris：10mm，ph=7、8、9）的配制：确称取tris0.6057g于500ml烧杯中，用400ml三重蒸馏水将其完全溶解，用稀盐酸溶液调节ph分别至7、8、9，移液至500ml容量瓶。烧杯用三重蒸馏水洗涤三次，润洗液转移入容量瓶内，定容，混合均匀备用。

2.将retdna用tris-hcl缓冲溶液溶解，浓度为100μm。

3.tht存储液（50ml，100μm）的配制：准确称取tht1.6mg，加入50ml三重蒸馏水将其溶解，混合均匀，4℃避光保存，备用，浓度即为100μm。

实施例1

基于荧光染料tht、ret基因体系的例温度计构建：

1.分别取10μlretdna（100μm），10μltht(100μm)，980μl20mmtris-hcl(ph=7、8、9)，在间隔3℃温度下恒温培养30分钟。

2.检测荧光，激发425nm下，在525nm处有明显荧光，体系在4-55℃区间随温度变化的荧光强度变化如图1至6所示。利用体系特性可用于制作温度计。

实施例2

在中性环境（ph=7）下，同一体系分别在25-40℃下每一度恒温培养30分钟，检验循环性。

在25-40℃检测荧光强度，对每一度均有明显响应且能区分开，重复测试三次以上，如图7至9所示，本实施例重复测试六次，取每度荧光强度的平均值，设计成“体温计”。