一种外泌体的富集方法与流程

本发明涉及一种外泌体富集方法及其在生物样品中外泌体的快速富集的应用。具体地说是一种基于低温条件下，peg聚合物捕获外泌体，进而在低速离心条件下富集外泌体的方法。

背景技术：

在十九世纪六七十年代，研究人员在细胞外，如软骨、血和细胞培养液中，发现了许多膜包被的囊泡小体(j.cellbiol.1969,41,59-72.)。起初，人们发现其中的某些囊泡是通过细胞质膜向外出芽的方式进行释放。直到80年代，人们又发现了一种更为复杂的囊泡分泌方式。细胞内的核内体先形成多泡小体，并通过质膜融合的方式将其中包含的小囊泡释放到细胞外(j.biol.chem.1987,262,9412-9420)。人们详细地研究了这类囊泡的分泌形式，并首次将这一类囊泡命名为外泌体(exosomes)。后续的研究表明，包括exosome在内，所有的外泌体都包含有蛋白质、核酸物质、脂质物质。这些物质赋予了外泌体很多功能功能，翻开了外泌体研究新的篇章(stemcells2015,33,1200-1212)。

当前的外泌体富集方法中，是超速离心和密度梯度离心法是公认的金标准，但是对设备的依赖性限制了他们的广泛使用。基于高分子聚合物的沉淀富集方法因其操作简单而被广泛采用。但是该方法通常需要过夜孵育处理才能实现较高的回收效率。我们在研究中发现，合适浓度的peg可以实现外泌体的高回收率提取。在低温环境下，将peg加入到生物样品溶液中，通过短时间的静置后，在合适的温度下溶解，通过低速离心可以获得外泌体成分。因此，选择合适的peg沉淀溶液，通过低温处理，可以在短时间内实现外泌体成分的富集，对于分析生物样本，尤其是大样本量的临床体液样本，具有较大意义。

参考文献：

1.anderson,hc,vesiclesassociatedwithcalcificationinthematrixofepiphysealcartilage[j].j.cellbiol.1969,41(1):59-72.

2.johnstone,rm；adam,m；hammond,j；orr,l；turbide,c,vesicleformationduringreticulocytematuration.associationofplasmamembraneactivitieswithreleasedvesicles(exosomes)[j].j.biol.chem.1987,262(19):9412-9420.

3.vaidyanathan,r；naghibosadat,m；rauf,s；korbie,d；carrascosa,lg；shiddiky,mj；trau,m,detectingexosomesspecifically:amultiplexeddevicebasedonalternatingcurrentelectrohydrodynamicinducednanoshearing[j].anal.chem.2014,86(22):11125-11132.

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种外泌体富集方法，可以实现生物样品中外泌体的快速富集。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

取1μl-100ml生物样品，例如细胞培养液，菌株培养液，组织培养液，及各种体液样本及临床检测用液体检材，如血液、尿液，唾液，精液，胆汁，脑脊液，呼吸道清洗液，等等。进行预处理，首先在200g-500g条件下离心3-15分钟，然后吸取上清液，在2000g-5000g条件下离心10-30分钟，最后在10000g-20000g条件下离心0.5-3h。最后一步离心操作可以改为经过0.1-0.3微米的滤膜进行过滤。使用ph值为6-8的水、细胞培养用pbs缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液配置分子量为2000-50000da的peg母液，配制的质量浓度为30-80％的peg溶液作为母液加入到生物样品中，使终浓度达到2-10％。向生物样品中加入dmso，丙酮，丁醇中的一种或几种有机溶剂，使其终浓度范围为0-80％。向生物样品中加如盐溶液，可以为氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钠等的一种或几种，使其终浓度范围为0-300mm。将加入各种添加物的混合液混匀后，放置于-200℃至+10℃环境中，静置1min-60min。然后将样品置于0℃-37℃进行温度平衡，至样品呈均匀溶液。将样品在500g-5000g条件下进行离心5min-30min，得到沉淀为外泌体。将外泌体，溶解在pbs中，再进行一次沉淀操作，获得进一步纯化的外泌体。

所得的外泌体可用于临床生物化学检测、基因组学、代谢组学、蛋白质组学分析及活性研究。

本发明的优点为：低温处理可以明显减少处理时间，适用于生物样品中外泌体的快速处理。

附图说明

图1多次重复试验显示处理方法具有较高的重现性；

结果显示：6次处理方法得到的蛋白质组学结果具有较好的重现性。

图2富集外泌体蛋白质组学结果用于疾病的分型分析；

结果显示：通过对富集得到外泌体进行分析，可以对32例病人样本进行初步疾病分型分析。

具体实施方式

实施例1

将10ml人尿液置于200g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg10000的pbs溶液，使peg终质量浓度为8％，加入氯化钠使终浓度为150mm，加入dmso使终体积浓度为5％，将样品置于-20℃，静置时间30min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在500g条件下进行离心，时间30min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示样品该处理流程得到的技术重现性较高(附图1)。

实施例2

将10mlhela细胞培养液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg水溶液使peg20000终质量浓度为8％，加入dmso使终体积浓度为10％，将样品置于-80℃，静置时间10min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在5000g条件下进行离心，时间5min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。

实施例3

将0.2ml人血浆，用pbs稀释至10ml，500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心20分钟，10000g条件下离心1h。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg2000的pbs溶液使peg终质量浓度为12％，加入氯化钠使终浓度为50mm，加入丁醇使终体积浓度为5％，将样品置于-60℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在4000g条件下进行离心，时间20min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示多数蛋白归属于exocart数据库。

实施例4

将0.2ml人血浆，用pbs稀释至10ml，1000g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清20000g条件下离心2h。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg20000的磷酸缓冲液(50mm)使peg终质量浓度为10％，加入氯化钠使终浓度为200mm，将样品置于-80℃，静置时间30min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在4000g条件下进行离心，时间20min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果中的鉴定到了80个exocarta数据库中前鉴定频率最高的前100位的蛋白质

实施例5

将8ml人尿液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg8000的pbs溶液，使peg终质量浓度为10％，加入氯化钠使终浓度为20mm，将样品置于-80℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在3000g条件下进行离心，时间15min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。对病人及患者的尿液外泌体进行蛋白质组学分析，可进行肾脏疾病的分型分析(附图2)。

实施例6

将8mlhela细胞培养液置于250g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清15000g条件下离心1h。向上清液中加入质量浓度为50％的peg2000水溶液，使peg终质量浓度为8％，加入dmso使终体积浓度为10％。将样品置于-20℃，静置时间40min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在1500g条件下进行离心，时间25min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。westen-bloting结果显示鉴定到外泌体标志物cd9。

实施例7

将2ml人尿液于4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg10000水溶液，使peg终质量浓度为10％，加入氯化钠使终浓度为150mm。将样品置于-186℃，静置时间10min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在2000g条件下进行离心，时间10min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。

实施例8

将2mlhela细胞培养液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心5分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的peg8000的水溶液，使peg终质量浓度为15％，将样品置于-20℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在5000g条件下进行离心，时间15min。离心后所得沉淀为外泌体样品。nta分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。