本发明属于荧光成像技术领域，具体的说是涉及一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统。
背景技术：
光学显微镜是一种利用光学透镜产生影像放大效应的显微镜，正置显微镜是光学显微镜的一种，在透射光观察下，光源由机身下面经过聚光镜到达样品，再穿过位于样品上方的物镜，然后借由反射镜和透镜到达观察者的眼睛或其他成像仪器，正置显微镜的优点是结构简单，易于改造。荧光显微成像技术是指使用荧光来产生一个图像的技术。样品被照射特定波长或波段的光，其被荧光团吸收，导致它们发出更长波长的光，例如和被吸收的光不同的颜色。通过使用光谱发射滤片，该照明光被从弱得多的发射荧光中分离出来。近年来，在生物学研究中，荧光标签被广泛地使用来标定生物分子，使荧光显微镜变得更加重要，荧光显微镜是以水银灯或氙气灯为光源，搭配具激发滤片、发散滤片组的光学仪器。荧光显微成像系统被广泛用于细胞生物学的研究中，是细胞水平研究必备的工具之一。
近红外荧光成像属于光学成像的一种，近红外光源的波长范围是700～900nm，为人们最早发现的非可见光区域，在可见光区400～700nm的成像存在着许多问题，比如会受到生物组织中内源性物质，如有氧、无氧血红蛋白、黑色素、水和胆红素等的吸收、散射等对光学成像的影响。然后在近红外区域，组织的吸收、散射和自发荧光背景都很低，近红外光源能在生物组织内达到最大穿透深度，并能进行深层组织成像，因而称此波段范围为“近红外组织透明窗口”。上转换荧光成像基于上转换荧光探针，有别于其他的荧光探针，在长波长的外界光源激发下可以发射短波长的荧光，这种独特的发光性质使得上转换荧光探针在进行荧光成像时，可以大大避免生物组织的自发荧光干扰，而且上转换荧光探针的光稳定性也很高，不容易发生荧光淬灭等问题，适用于生物体的长期荧光成像观测。
荧光显微系统其造价相对低廉、成像速度快、灵敏度高，近红外光和上转换发光均具有成像深度好、噪音低的优点，基于上述优点，发展能够实现近红外光和上转换发光的显微成像显微系统十分必要，同时由于与he染色等病理检测共定位的需要，简单切换即实现原位的彩色成像、近红外发光和上转换发光成像对细胞水平的研究具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统，该多功能宽场正置显微系统主要由正置荧光显微镜镜体、激光器、准直扩束镜、白光光源、第一可调式反射镜、二向色镜、激发滤光片转盘、近红外通透物镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜、高灵敏度检测器和彩色相机组成；在正置荧光显微镜镜体内由下至上依次集成设置有近红外通透物镜、激发滤光片转盘、二向色镜、发射滤光片转盘、第二可调式反射镜和高灵敏度检测器，在正置荧光显微镜镜体内位于第二可调式反射镜的侧面设置有彩色相机，在正置荧光显微镜镜体的外部位于安装二向色镜位置的侧面依次安装有第一可调试反射镜、准直扩束镜和激光器，白光光源设置于第一可调式反射镜的上方。
激发滤光片转盘含有激发滤光片，发射滤光片转盘含有发射光滤光片，激发滤光片和发射光滤光片采用短通滤光片、带通滤光片或长通滤光片。
激光器采用中心波长为980nm、808nm或730nm的激光器。白光光源采用汞灯或led灯。高灵敏度检测器采用scmos检测器或制冷性emccd检测器。
本发明正置显微系统中各部件的功能为：
1、正置荧光显微镜镜体作为各部件连接和物理固定。
2、激光器作为近红外发光成像和上转换发光成像的激发光源。
3、准直扩束镜用于激光器的准直和扩束。
4、白光光源作为激发光的发射光源。
5、第一可调式反射镜可以对光源进行切换，切换激光光源和白光光源。
6、二向色镜可以反射激发光到样品对其进行激发，同时可以透过发射光，使发射光可以被检测器接收。
7、激发滤光片转盘含有激发滤光片，激发滤光片能够选择性的透过激光器、汞灯、led光源发射光作为激发光。
8、近红外通透物镜专用于红外光的透镜组。
9、发射滤光片转盘含有发射光滤光片，发射光滤光片能够选择性的透过目标发射光。
10、第二可调式反射镜可以用于实现高灵敏度检测器和彩色相机之间的自由切换。
11、高灵敏度检测器用于收集样本激发后发射的荧光。
12、彩色相机用于可见光波段的彩色成像。
正置荧光显微镜：nikonni-u是一款扩展性极强的科研级正置显微镜，采用无限远光学系统，可方便地搭载其他附件。在此系统中搭载了双层荧光转盘，每层荧光转盘具备六个滤光块空位，系统还配备了双相机端口及双光源接口，以同时满足生物荧光材料及上转换发光材料的应用。在主要光学部件上，如物镜选择近红外透过率较高例如大于70％的平场荧光物镜。另外在确保不影响成像的前提下，移除光路中对红外光有阻挡作用的光学部件，从而最大限度地提高整个光学系统在近红外光的通过率。
激光器采用高功率大芯径多模光纤，以达到更强的激发光强度。光纤采用多模光纤，芯径200um，外加准直扩束镜进而实现均匀的视场照明。相机除了精准的滤光片组合及高透过率的物镜外，为了得到高信噪比的荧光图像，系统还需配备高灵敏度的探测器，如emccd或scmos。
二向色镜与普通荧光用的二向色镜不同，本发明中采用的为短通型滤光片，即短于分光波长的光透过，而长于分光波长的光被反射。被反射的近红外光照射到样品后，样品激发出的荧光通过第一阻挡滤光片，让400nm～850nm的光透过，其余波长的光被过滤掉，避免对背景信号造成干扰。要求二向色镜及第一阻拦滤光片的od值至少大于6，以增加信噪比。本发明中的正置显微系统采用的是美国chroma公司的zt1064rdc-sp二向色镜及et850sp-2p，光谱图如图2所示，其中zt1064rdc-sp为灰色平滑状线，et850sp-2p为黑色锯齿状线。
激发和发射滤光片：为了进一步区分出不同波长的发射光，系统中增加了第二阻挡滤光片，波长分别为et550/50m、et630/75m及et811/80m，光谱图如图3、图4及图5，其中黑色线为第一阻挡滤光片。此外，由于常规的荧光显微镜光源采用的是汞灯，热量比较高，所以光路通常会有隔热片。而隔热片会将近红外及红外光阻挡，所以本系统对显微镜荧光光路中的相关光学部件也进行了移除。激发滤光片转盘和发射滤光片转盘可以任意更换滤光片，在成像过程中也可实现滤光片的自由切换。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种上转换发光近红外成像和彩色显微成像系统，该系统能够利用近红外光、上转换发光信噪比高、噪音低的特点，通过近红外光激发，采用高灵敏度探测器检测探针的可见光或近红外光发射，同时可以通过切换实现样本的彩色成像，最终实现探针的材料、细胞或者生物组织的实时、非侵入式的高灵敏度成像。本发明中的显微系统能够发射激发光，通过对标记有正常荧光探针、近红外荧光探针、上转换发光探针的材料、细胞、组织和活体动物进行实时的高信噪比的荧光显微成像，同时可以在不移动样本和移动镜头的情况下，使用彩色相机进行共定位彩色成像。本发明通过合理搭配滤光片光谱范围，选择高透过率的显微镜物镜及高od值滤光片，同时配备高灵敏度的探测器，在宽场照明下同样可以达到高信噪比的上转换荧光图像。
本发明基于正置显微镜，通过改造系统的光学部件，增加可见光和近红外光高灵敏探测器和彩色成像系统，增加高功率激光器，并增配高效滤光片系统，构建了一套能够进行上转换成像、近红外成像和彩色成像的正置显微系统。本发明与以往的显微成像系统相比，具有高灵敏度和高信噪比，是一种能够进行可见光、近红外光和上转换发光成像的一体化显微成像设备。
与现有技术相比，本发明中的成像系统还具有以下优点：1、首次实现了将普通荧光成像、近红外显微成像技术、上转换活体荧光显微成像技术和彩色成像技术全部集成到一台显微系统中；2、可以在成像过程中自由切换至普通荧光成像模式、近红外光成像模式、上转换发光成像模式和彩色成像模式，从而实现不同成像结果的共定位；3、近红外显微成像和上转换活体荧光显微成像具有更高的信噪比。
附图说明
图1是本发明正置显微系统的系统光路示意图；
图2是本发明中二向色镜和第一阻挡滤光片的光谱图；
图3是本发明的et550/50m滤光片光谱图；
图4是本发明的et630/75m滤光片光谱图；
图5是本发明的et811/80m滤光片光谱图；
图6是采用本发明正置显微系统得到的高信噪比上转换荧光图像；
图中：1-正置荧光显微镜镜体；2-激光器；3-准直扩束镜；4-白光光源；5-第一可调式反射镜；6-二向色镜；7-激发滤光片转盘；8-近红外通透物镜；9-发射滤光片转盘；10-第二可调式反射镜；11-高灵敏度检测器；12-彩色相机。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述。
如图1至图6所示，一种上转换发光近红外和彩色成像多功能宽场正置显微系统，该多功能宽场正置显微系统主要由正置荧光显微镜镜体1、激光器2、准直扩束镜3、白光光源4、第一可调式反射镜5、二向色镜6、激发滤光片转盘7、近红外通透物镜8、发射滤光片转盘9、第二可调式反射镜10、高灵敏度检测器11和彩色相机12组成；在正置荧光显微镜镜体1内由下至上依次集成设置有近红外通透物镜8、激发滤光片转盘7、二向色镜6、发射滤光片转盘9、第二可调式反射镜10和高灵敏度检测器11，在正置荧光显微镜镜体1内位于第二可调式反射镜10的侧面设置有彩色相机12，在正置荧光显微镜镜体1的外部位于安装二向色镜6位置的侧面依次安装有第一可调试反射镜、准直扩束镜3和激光器2，白光光源4设置于第一可调式反射镜5的侧端。
激发滤光片转盘7含有激发滤光片，发射滤光片转盘9含有发射光滤光片，激发滤光片和发射光滤光片采用短通滤光片、带通滤光片或长通滤光片。激光器2采用中心波长为980nm、808nm或730nm的激光器2。白光光源4采用汞灯或led灯。高灵敏度检测器11采用scmos检测器或制冷性emccd检测器。
本发明的系统构成包括正置荧光显微镜镜体1、彩色+单色成像双端口、白光led+激光器2双光源接口、双层荧光滤光块转盘以及一系列实现功能的激发和发射滤光片组成。此系统基于一台正置荧光显微镜nikonni-u，光源采用980nm连续激光的光纤导入，通过准直扩束后均匀地射入显微镜光路，经过二向色镜6分光后，反射通过物镜并照射到样品上，样品产生的荧光及未被吸收的激发光通过物镜回到二向色镜6分光后，使用高灵敏度相机接收光信号，数字化后由电脑软件进行处理。同时在相机第二接口安装彩色相机12，能够实现高灵敏度成像的同时进行彩色信号的获取，如图1所示。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。