本发明属于毒素蛋白的定量检测领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis,简称bt)，是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体，苏云金芽胞杆菌以色列亚种(bacillusthuringrensissubsp.israelensis，简称bti)是goldberg和margalit于1977年发现的一种对蚊科幼龄害虫具有高度毒力的病原细菌，主要有效成份也是伴孢晶体，由多种毒素蛋白组成，其中分子量为128kd和65kd的两种毒素蛋白是主要成分。bt类产品的质量检测与控制，目前最有效的方法是生物测定，但因生物测定受靶标昆虫质量、数量及外界条件等影响，检测误差高达40％。bt类产品的毒素蛋白含量测定在我国国标与化工行业标准中均采用sds-page凝胶电泳方法，如hg3617-1999的化工行业标准中报道的苏云金杆菌可湿性粉剂的毒素蛋白含量测定方法，用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过sds-page，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其它杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。该方法能测出苏云金芽胞杆菌中分子量为130kd的毒素蛋白含量，但目前还没有同时测出苏云金芽胞杆菌以色列亚种中分子量为128kd和65kd的两种毒素蛋白含量的方法报导。申请人曾尝试参照bt可湿性粉剂标准hg3617-1999中毒素蛋白的检测方法来检测bti中晶体蛋白含量，结果发现随着bti试样取样量的增加，bti毒素蛋白含量越来越低，甚至不出现晶体蛋白条带，说明用现有的bt毒素蛋白的检测方法无法准确定量bti毒素蛋白，因此迫切需要建立一种准确度高、受外界影响因素小的bti类产品晶体蛋白含量测定方法，从而更好地控制bti类产品的质量。技术实现要素：本发明的目的是针对苏云金芽胞杆菌以色列亚种中毒素蛋白含量测定的空白，提供一种能准确测定苏云金芽胞杆菌以色列亚种中分子量为128kd和65kd的两种毒素蛋白含量的方法。本发明提供的方法包括以下步骤：1)取苏云金芽孢杆菌以色列亚种待测样品，加入ph为7-9、浓度为0.05-0.2mol/l的磷酸缓冲液，充分混匀后离心，弃去上清，再加入水，充分混匀后离心，弃去上清；2)向收集到的菌泥中加水，充分悬浮，然后再加入氢氧化钠溶液使氢氧化钠终浓度达0.1mol/l，摇匀，静置后再加入样品稀释液，于沸水浴中加热5-10min，冷却后离心，取上清，配制成样品溶液；3)配制sds-page，加入样品溶液，进行凝胶电泳操作；4)电泳后的胶片经固定、染色、漂洗、脱色、成像，根据蛋白带区域的强度值计算含量。优选地，所述磷酸缓冲液的ph为8.0、浓度为0.1mol/l。优选地，所述sds-page包括分离胶和浓缩胶，所述分离胶由30％acr-bis5ml、ph8.8分离胶胶缓冲溶液3.8ml、ddh2o5.9ml、10％sds150μl、10％ap150μl、temed14μl组成；所述浓缩胶由30％acr-bis0.85ml、ph6.8浓缩胶缓冲溶液0.625ml、ddh2o3.4ml、10％sds50μl、10％ap50μl、temed8μl组成。本发明针对目前国内外苏云金芽胞杆菌以色列亚种(bti)中毒素蛋白含量测定的空白，在现有苏云金芽胞杆菌(bt)毒素蛋白含量测定方法(化工行业标准hg3617-1999)的基础上，通过采用特殊的样品预处理方法，解决了试样中杂质干扰毒素蛋白定量检测的问题，同时对sds–page凝胶配方进行了优化，进一步改善了凝胶电泳图谱中两种蛋白带的迁移率、分辨率和蛋白带形态，使测得的结果更加准确。其中128kd与65kd毒素蛋白的含量与相应的条带强度呈现良好的线性关系，相关性到达到0.99。本发明能同时检测bti类产品中两种主要毒素蛋白的含量，检测结果准确性高、重复性好，检测误差可以控制在平均值的5％以内。本发明能用于bti类产品的质量控制，具有操作简单易行、快速、成本低、受外界环境影响小等优点。附图说明图1为试样用不同的预处理方法处理后的电泳图，其中1为方法一称样量为30mg电泳图，2为方法一称样量为50mg电泳图，3-5分别为方法二、方法三、方法四电泳图，6-7为方法五重复两次的电泳图，8为方法六电泳图，9-10为方法七重复两次的电泳图。图2为用方法七处理不同质量的bti样品得到的毒素蛋白电泳图。图3为128kd蛋白带的强度值与bti毒素蛋白质量的线性关系。图4为65kd蛋白带的强度值与bti毒素蛋白质量的线性关系。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1方法提要：用磷酸缓冲液和水对苏云金芽胞杆菌以色列亚种原粉进行预处理，减少试样中的杂质干扰，然后用碱性溶液处理原粉中的伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，接着通过sds-page，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其它杂蛋白分离，最后用电泳图像扫描仪扫描蛋白区，根据蛋白带区域的强度值进行定量。1.试剂和溶液四甲基乙二胺(temed)。0.55mol/l氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠2.2g，用水稀释至100ml。10％过硫酸铵溶液(10％ap)：称取过硫酸铵0.1g，用水稀释至1ml。10％十二烷基硫酸钠溶液(10％sds)：称取十二烷基硫酸钠10.0g，用水稀释至100ml。0.1mo1/l磷酸缓冲液(ph8.0)：称取无水磷酸氢二钾1.77g至烧杯中，加入0.1mol/l无水磷酸二氢钾溶液6ml(称取磷酸二氢钾13.61g至1l容量瓶中，水定容)，加水溶解，转移至100ml容量瓶中，用水定容至100ml。30％丙烯酰胺(30％acr-bis)：称取丙烯酰胺29.0g、亚甲基双丙烯酰胺1.0g，溶于100ml水中，中速定性滤纸过滤，于4℃暗处贮存备用。ph8.8分离胶缓冲溶液：称取三羟基甲基氨基甲烷(tris)30.25g，溶于水中，用浓盐酸调至ph8.8，用水定容至250ml。ph6.8浓缩胶缓冲溶液：称取三羟基氨基甲烷(tris)12.10g，溶于水中，用浓盐酸调至ph6.8，用水定容至100ml。ph8.3电极缓冲溶液：称取三羟基甲基氨基甲烷(tris)3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基磺酸钠(sds)1.0g，溶于水中，用浓盐酸调至ph8.3，用水定容至1000ml。样品稀释液：1mol/l、ph6.8tris-hcl缓冲液18.75ml，十二烷基磺酸钠6.0g，甘油30ml，巯基乙醇15ml，少许溴酚蓝，用水定容至100ml。染色液：称取考马斯亮蓝(cbb)r-250l.0g,加入甲醇450ml、冰乙酸100ml、水450ml，溶解混匀，过滤备用。脱色液：量取甲醇100ml、冰乙酸35ml于1000ml容量瓶中，水定容后备用。漂洗液：量取无水乙醇300ml、冰乙酸100ml、水600ml，混匀后备用。固定液：量取75ml冰乙酸于1000ml容量瓶中，水定容。毒素蛋白标准品：毒素蛋白(相对分子量为130kd)含量为11.7％的原粉。2.标样溶液的配制称取毒素蛋白标准品45mg(精确至0.01mg)于10ml离心管中，加5ml水，充分混匀，移取0.5ml至1.5mlep管中，混匀，加入0.55mol/l氢氧化钠溶液0.125ml(氢氧化钠终浓度为0.1mol/l)，摇匀，静置5min，再加入样品稀释液0.325ml，总体积为0.95ml，于沸水浴中煮6min，冷却至室温，7000r/min离心15min，取上层清液，以备电泳上样。3.待测样品的预处理称取bti原粉30mg于1.5mlep管中，加入1.3ml0.1mol/l的磷酸缓冲液(ph8.0)，混匀，15000r/min离心2min，弃去上层清液，再加入1.3ml水，混匀，15000r/min离心2min，弃去上层清液，收集菌泥。4.样品溶液的制备向步骤3收集到的菌泥中加入0.5ml水，充分混匀，加入0.125ml0.55mol/l氢氧化钠溶液(氢氧化钠终浓度为0.1mol/l)，摇匀，静置5min，再加入样品稀释液0.325ml，混匀，于沸水浴中煮6min，冷却至室温，7000r/min离心15min，取上层清液，以备电泳上样。5.sds-page电泳5.1聚丙烯酰胺凝胶制备按表1配方分别配制分离胶与浓缩胶，先配制分离胶，最后根据室温高低加入适量temed，室温高可适量少加tmed，使胶凝固时间在30-40min左右，混匀后迅速倒入灌胶模具中，液面距凹槽玻璃板顶端3cm左右，并轻轻加入约1ml水至胶液面，注意不要扰乱液面。待胶凝固后倒出水，用滤纸条吸干水。按表1配制浓缩胶，混匀后迅速倒入分离胶上面，液面至凹槽玻璃板顶端，迅速插上10孔梳。表1sds–page凝胶配方贮备液分离胶浓缩胶30％acr-bis5ml0.85mlph8.8分离胶胶缓冲溶液3.8ml0ph6.8浓缩胶缓冲溶液00.625ml二次蒸馏水5.9ml3.4ml10％sds150μl50μl10％ap150μl50μltemed14μl8μl5.2进样：将凝胶模具放入电泳槽中，打开凝胶模具下方密封口，并向阴、阳两极槽加入适量ph8.3电极缓冲液，阴极槽加满，阳极槽中电极缓冲液没过电泳模具下封口即可。小心取出凝胶中的梳子，用10μl微量进样器分别吸取10μl、8μl、6μl、4μl、2μl上述标样溶液注入到不同的上样孔中，用于制备标准曲线，再取6μl样品溶液注入到试样上样孔中，盖上电泳槽盖，接通电源。5.3电泳：调节电泳仪电源电压为100v、电流为50ma，开始电泳。待溴酚蓝指示剂前沿离开浓缩胶，进入分离胶后，调节电泳仪电源电压至120v。待溴酚蓝指示剂前沿距胶边1cm左右时停止电泳，取出胶片，用样品梳刀切去浓缩胶，小心将分离胶剥离至玻璃培养皿中。5.4固定：用7.5％乙酸将电泳后的分离胶片浸泡30min以上。5.5染色：用考马斯亮蓝染色液染色4h以上。5.6漂洗、脱色：先用漂洗液漂洗20min左右，再用脱色液脱色至背景清晰为止。6.扫描及数据处理胶片经脱色后，用电泳凝胶成像系统将凝胶进行成像，保存于电脑。用labscan5.0软件对蛋白带进行图像分析。标准品中130kd毒素蛋白含量为11.7％，标样溶液进样量为10μl、8μl、6μl、4μl、2μl，根据标准品称样量与处理后最终体积计算出进样毒素蛋白质量依次为5.54μg、4.43μg、3.32μg、2.22μg、1.11μg。以标样溶液蛋白带强度值为横坐标，130kd进样毒素蛋白质量为纵坐标作标准曲线y＝ax+b。软件自动按试样溶液蛋白带强度值计算出进样试样中128kd与65kd毒素蛋白的质量。供试样品中两种主要分子量(128kd、65kd)毒素蛋白的质量分数w(％)，按以下公式计算。式中：m——称取试样质量，mgv1——注入凝胶上样孔的试样溶液体积，μlm1——从标准曲线上查得的试样溶液中毒素蛋白的质量，μgv2——试样最终定容体积，ml实施例21.消除bti试样中干扰物质的方法摸索bti试样中存在的糖类、絮凝剂等物质干扰了毒素蛋白-sds胶束的形成，随着bti试样取样量增加，干扰物质也逐渐增加，当达到一定量，毒素蛋白-sds胶束完全不能形成，从而出现空白蛋白带现象，导致bti试样中的毒素蛋白无法检出，因此首先需要对bti试样中的干扰物质进行去除，才能准确定量bti试样中的毒素蛋白。为了找到消除bti试样中干扰物质的最佳试剂，采用以下七种方法对bti原粉进行不同的预处理实验，收集菌泥，然后参照实施例1中的方法配制样品溶液并检测两种主要毒素蛋白含量。并改变bti原粉的称样量，考查了方法一、方法二、方法五、方法七的蛋白带强度值与毒素蛋白含量关系是否成线性关系。方法一，未用任何试剂处理试样。方法二，水洗试样1次，15000r/min离心2min,弃去上清。方法三，水洗试样2次，15000r/min离心2min,弃去上清。方法四，水洗试样3次，15000r/min离心2min,弃去上清。方法五，加入1.3ml0.1mol/l的盐酸，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清，再加入1.3ml水，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清。方法六，加入1.3ml0.1mol/l的盐酸，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清。再加入1.3ml水，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清，再加入1.3ml水，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清。方法七，加入1.3ml0.1mol/l的ph8.0磷酸缓冲液，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清，再加入1.3ml水，混匀，15000r/min离心2min，弃去上清。实验中选择了七种不同的样品预处理方法，通过图1和表2的结果可以看出，方法一未用任何试剂处理样品，检测结果比其它方法低，试样取样量增加至50mg，出现空白蛋白带现象；方法二至方法四是用水洗样品的处理方法，均不能有效地消除干扰物质，即使增加水洗次数也没有效果，不能解决背景颜色深的问题；方法五和方法六用盐酸洗会造成背景颜色加深，增加水洗次数也不能予以解决，不能有效地消除干扰物质；用方法七处理，结果显著高于其它方法，且胶片脱色后背景较其它方法清晰，说明方法七优于其它方法。表2不同预处理方法测得的毒素蛋白含量方法称样量128kd毒素蛋白65kd毒素蛋白方法一30mg1.30％1.21％方法一50mg无特征带无特征带方法二30mg1.84％1.33％方法三30mg1.80％1.26％方法四30mg1.79％1.28％方法五30mg胶片背景色深，无法定量胶片背景色深，无法定量方法六30mg胶片背景色深，无法定量胶片背景色深，无法定量方法七30mg2.24％1.66％为了确定最佳预处理工艺，又进一步考查了方法二、三、四、七的蛋白带强度值与毒素蛋白质量是否成线性关系，方法如下：分别称取bti原粉50mg、40mg、30mg、20mg、10mg，按方法二、三、四、七进行预处理后配制样品溶液并进行凝胶电泳，上样量均为4μl，分析蛋白带强度值与毒素蛋白质量线性关系，结果见表3。表3不同预处理方法的蛋白带强度值与毒素蛋白质量的线性关系考查方法蛋白带强度值与毒素蛋白质量关系方法二非线性方法三非线性方法四非线性方法七线性通过表3结果分析可以看出，方法二、三、四两种蛋白带强度值与毒素蛋白质量均不成线性关系，方法七蛋白带强度值与毒素蛋白质量线性关系良好，说明方法七测得的结果准确。图2为用方法七处理不同取样量得到的bti毒素蛋白电泳图，五个取样量依次为1-5泳道。从图中可以看出，随着取样量的减少，蛋白带强度值逐渐降低。表4为方法七处理不同取样量得到蛋白带强度值与毒素蛋白质量的关系，从表4可以看出，方法七处理后的蛋白带强度值与毒素蛋白质量存在良好的线性关系。表4方法七处理不同取样量得到的蛋白带强度值与毒素蛋白质量泳道12345试样质量(mg)49.8139.9231.2020.9110.52128kd毒素蛋白质量(μg)3.3692.6792.1091.4190.723128kd蛋白带强度值571120471571387018297761636965kd毒素蛋白质量(μg)4.5943.6542.8761.9350.98565kd蛋白带强度值7498546383255297943948322160根据表4绘制蛋白带强度值与bti毒素蛋白质量的线性图，如图3和如图4所示。128kd蛋白带线性方程为：y＝0.0007x-0.4612，r2＝0.9939。65kd蛋白带线性方程为：y＝0.0007x-0.6897，r2＝0.9956。可以看出，128kd蛋白带强度值和65kd蛋白带强度值均与bti毒素蛋白质量成线性关系，相关系数大于0.99，因此可以根据蛋白带强度值准确测定bti样品中两种毒素蛋白的含量。2.方法重复性考查为了验证本方法的重复性，对同一批bti原粉进行七次重复测定，考查同一样品毒素蛋白含量的稳定性，实验结果如表5所示。从结果可以看出，七次结果的变异系数为2.67％(128kd)和2.21％(65kd)，方法重复性好。表5方法重复性实验的结果当前第1页12