本发明涉及医学生物检测技术领域，涉及白介素31作为分子标志物在原发性胆汁性胆管炎诊断中的应用，尤其涉及白介素31在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
原发性胆汁性胆管炎(primarybiliarycholangitis，简称pbc)是一种比较常见的慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病，如不及时诊断和治疗会逐渐发展为肝硬化，甚至肝衰竭和肝癌而威胁生命。目前，血清中的抗线粒体抗体(ama)及其m2亚型是pbc最重要的辅助诊断指标，但该指标存在一定比例的漏诊和误诊，而且无法判断pbc的病情。对于ama及其m2亚型阴性的pbc患者，其诊断主要依赖于肝组织学检测，但这种损伤性检查患者不愿接受。
因此，本领域迫切需要寻找能对pbc进行早期诊断和病情判断的操作简单便捷的无创性指标。这方面研究对于pbc早发现、早治疗，预防肝硬化、肝衰竭和肝癌的发生，减少患者死亡具有重要意义。
白介素31(il-31)属于gp130/il-6家族一员，其编码基因位于染色体12q24.31，genbank号为nc_000012.12。很多免疫细胞都可以分泌il-31，包括活化cd4+t细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞等。il-31主要参与过敏性疾病的发生，如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等。研究发现，il-31在特应性皮炎患者中表达明显上调，而且参与该疾病的炎症，并能引起瘙痒。另外，在脊柱关节病、骨质疏松及多种肿瘤患者中都发现，血清il-31明显增高。但迄今为止，国内外尚无文献报道il-31与pbc的关系，更缺乏应用相关检测技术检测血清il-31水平对pbc的诊断和病情判断价值，该指标也尚未在临床上得到应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供原发性胆汁性胆管炎的诊断标志物，也在于提供白介素31的新用途，即在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂盒中的应用。
发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用u-plex电化学发光检测技术检测患者血清中的提供白介素31(il-31)表达量，能够比较准确地对原发性胆汁性胆管炎(pbc)进行诊断和病情评估。基于提供白介素31(il-31)在血清中的表达量与原发性胆汁性胆管炎(pbc)的这种相关性，以该分子作为生物标志物对其表达量进行检测可用于指导原发性胆汁性胆管炎(pbc)的早期诊断和病情判断。
本发明的第一方面，提供了白介素31作为原发性胆汁性胆管炎诊断标志物的应用。所述的原发性胆汁性胆管炎(pbc)是指一种以肝内中小胆管炎症损伤为主要特征的慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病。
本发明的第二方面，提供了白介素31在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
优选的，所述的诊断试剂为定量检测生物样品中白介素31表达量的试剂。
优选的，所述的诊断试剂盒包含了定量检测生物样品中白介素31表达量的试剂。
优选的，所述的定量检测生物样品中白介素31表达量的试剂，选自：对白介素31具有检测特异性的抗体，该抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
更优选的，所述诊断试剂或诊断试剂盒为利用特异性白介素31的抗体，制备的u-plex电化学发光检测试剂或试剂盒。
根据临床经验，当采用u-plex电化学发光法检测白介素31(il-31)浓度高于15.2pg/ml时，提示患者可能发生了原发性胆汁性胆管炎(pbc)。
本发明的第三方面，提供了白介素31在制备原发性胆汁性胆管炎分期诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
优选的，所述分期诊断试剂或诊断试剂盒为定量检测生物样品中白介素31表达量的试剂。
更优选，分期诊断试剂或诊断试剂盒为利用特异性白介素31的抗体，制备的u-plex电化学发光检测试剂或试剂盒。
根据临床经验，当采用u-plex电化学发光法检测白介素31(il-31)浓度高于15.2pg/ml时，其水平越高，提示患者越可能处于原发性胆汁性胆管炎(pbc)早期，随着病程的进展，白介素31水平逐渐降低，与pbc进程呈负相关。
本发明用于检测的生物样品取自检测对象的静脉血。
除了上述的u-plex电化学发光检测法，还可以采用如下检测方法对生物样品中的白介素31表达量进行定量检测：酶联免疫吸附试验(elisa)(见文献yamamuraetal.natcommun.2017；8:13946)和磁珠为基础的bio-plex免疫检测法(见文献gaoetal.scirep.2016；6:20607)。
本发明的第四方面，提供了一种原发性胆汁性胆管炎的诊断试剂盒，该试剂盒包含了定量检测生物样品中白介素31表达量的试剂，对pbc进行诊断或分期确定。
优选的，该诊断试剂盒为u-plex试剂盒，包括u-plex微孔板、含生物素结合域及微孔板结合域的连接体，生物素标记的白介素31捕获抗体、sulfo-tagtm标记白介素31的检测抗体、白介素31标准品、样本稀释液、抗体稀释液、终止液、读板液和清洗缓冲液。
此外，本发明还可以利用市售的白介素31(il-31)电化学发光检测试剂盒(如美国mesoscalediscovery公司)，体外检测白介素31(il-31)在原发性胆汁性胆管炎(pbc)患者血清中的表达量。
本发明的第五方面，提供了一种利用上述诊断试剂盒进行原发性胆汁性胆管炎检测或分期诊断的方法，如下：
(1)通过静脉穿刺采血，按照采血管制造商的程序文件分离血清。标本在检测之前可置于2℃～8℃贮存3天，若长期保存标本可将其置于-80℃超低温冰箱。测试前，将冷冻标本置于室温后，在分析前应轻轻翻转试管多次，使其充分混匀。
(2)使用前将所有试剂平衡至室温(20℃-25℃)。
(3)采用连接体和生物素标记的il-31捕获抗体复合物包被u-plex微孔板，准备校准品、检测抗体和读板液。
(4)每孔先加入25μl样本稀释液，然后每孔对应加入25μl的样本、标准品，并用封膜封上板，放置于摇床上，室温孵育1小时。为了避免携带污染，不要使精密移液器的吸头触及液体的表面。
(5)温育后将孔内液体吸干，每孔加入150μl清洗缓冲液，清洗微孔板3次。
(6)每孔加入50μl的检测抗体，并用封膜封上板，放置于摇床上，室温孵育1小时。
(7)温育后将孔内液体吸干，每孔加入150μl清洗缓冲液，清洗微孔板3次。
(8)每孔加入2×读板液，放入msdsq120检测仪读板。
(9)采用拟合曲线法绘制标准曲线。每个患者标本未知的il-31浓度可根据其信号值从标准曲线上读出。
采用上述方法，分别对pbc患者、健康对照组和乙肝肝硬化患者(疾病对照组)的血清标本中il-31的表达水平进行检测，结果显示，pbc患者血清il-31的水平明显高于健康对照和乙肝肝硬化患者，差异具有显著的统计学意义(p<0.001)。
同时，应用roc曲线分析血清il-31水平对pbc的诊断价值。如图2所示，曲线下面积达到0.919，说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数最大的原则，判断出il-31的最佳临界值为15.2pm，对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为83.3％、95.2％、94.3％、85.5％和89.3％。
综上，提示白介素31在原发性胆汁性胆管炎细胞中的特异性和灵敏性高，可应用于原发性胆汁性胆管炎诊断。
此外，应用spearman相关性分析血清il-31水平与pbc患者肝组织学分期的相关性。利用spss软件通过spearman相关性分析的方法对pbc患者肝组织学不同分期(1、2、3、4期)血清il-31的水平进行分析，显示血清il-31水平与pbc组织学进展呈明显负相关，在pbc早期最高，随着pbc的发展，血清il-31水平逐渐降低(r＝-0.364，p＝0.004)，提示白介素31可用于pbc的分期诊断。
本发明的有益保障及效果如下：
申请人从上海长征医院取得了大量的原发性胆汁性胆管炎病人的血清标本，为本发明的研究提供了有力的保障。
就技术而言，本发明利用u-plex电化学发光检测技术测定患者血清中il-31分子的表达水平，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。结合大量临床信息，确定il-31的血清水平对于pbc具有明显的诊断意义，il-31分子能用于制备判断pbc的蛋白质分子标记，能够较敏感、特异地诊断pbc，并能对pbc的发展阶段进行初步评估。基于血清il-31水平与pbc的密切关系，以该分子作为生物标志物对其进行血清电化学发光法检测可用于指导pbc的准确诊断和病情判断，对于pbc患者病情判断和序贯治疗具有重要的指导意义。
此外，本发明的il-31分子与pbc相关性的发现为早期诊断pbc提供一条全新的途径，对于早期诊断和治疗pbc，评估pbc病情具有重要作用。当u-plex电化学发光法检测il-31浓度高于15.2pg/ml时，提示患者可能发生了pbc，而且有趣的是，早期pbc患者血清il-31水平最高，随着pbc的发展又逐渐降低。
附图说明
图1为pbc组、乙肝肝硬化组和健康对照组血清il-31的水平对比结果；
图2是本发明中血清il-31水平对pbc的诊断价值的roc曲线图；
图3是本发明中pbc患者肝组织学不同分期(1、2、3、4期)血清il-31的水平结果。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
在以下实施例中，研究对象的血清标本均来自上海长征医院。
实施例一：原发性胆汁性胆管炎与非原发性胆汁性胆管炎组织中白介素31的表达水平检测
随机选取60例pbc患者、30例健康对照和32例乙肝肝硬化患者(疾病对照)的血清(标本的获取均来自上海长征医院，并通过第二军医大学伦理审批)，采用u-plex电化学发光法检测il-31分子在各组血清中的表达水平。所用的il-31测定试剂盒(购自美国mesoscalediscovery公司)，具体步骤为：
(1)通过静脉穿刺采血，按照采血管制造商的程序文件分离血清。标本在检测之前可置于2℃～8℃贮存3天，若长期保存标本可将其置于-80℃超低温冰箱。测试前将冷冻标本置于室温后，在分析前应轻轻翻转试管多次，使其充分混匀。
(2)使用前将所有试剂平衡至室温(20℃-25℃)。
(3)按照说明书要求，采用连接体和生物素标记的白介素31(il-31)捕获抗体复合物包被u-plex微孔板，准备校准品、检测抗体和读板液。
(4)每孔先加入25μl样本稀释液，然后每孔对应加入25μl的样本、标准品，并用封膜封上板，放置于摇床上，室温孵育1小时。为了避免携带污染，不要使精密移液器的吸头触及液体的表面。
(5)温育后将孔内液体吸干，每孔加入150μl清洗缓冲液，清洗微孔板3次。
(6)每孔加入50μl的检测抗体，并用封膜封上板，放置于摇床上，室温孵育1小时。
(7)温育后将孔内液体吸干，每孔加入150μl清洗缓冲液，清洗微孔板3次。
(8)每孔加入2x读板液，放入msdsq120检测仪读板。
(9)采用拟合曲线法绘制标准曲线。每个患者标本未知的il-31浓度可根据其信号值从标准曲线上读出。
(10)如图1和表1所示，pbc患者血清il-31的水平明显高于健康对照和乙肝肝硬化患者，差异具有显著的统计学意义(p<0.001)，而后两者间差异无统计学意义(p＝0.662)。
表1不同组别血清il-31水平
实施例2：roc曲线分析
应用roc曲线分析血清il-31水平对pbc的诊断价值。在122例检测对象中，以pbc患者为靶对象，利用spss软件做出roc曲线，并分析相关的各种参数。
如图2所示，曲线下面积达到0.919±0.028(p<0.001)，说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数最大的原则，判断出il-31的最佳临界值为15.2pm，对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为83.3％、95.2％、94.3％、85.5％和89.3％，见表2所示。
表2il-31对pbc的诊断价值
实施例3：血清il-31水平与pbc患者肝组织学分期的相关性
应用spearman相关性分析血清il-31水平与pbc患者肝组织学分期的相关性。在60例pbc患者中，利用spss软件通过spearman相关性分析的方法显示。如图3所示的pbc患者肝组织学不同分期(1、2、3、4期)血清il-31的水平，可见血清il-31水平与pbc组织学进展呈明显负相关，在pbc早期最高，随着pbc的发展，血清il-31水平逐渐降低(r＝-0.364，p＝0.004)。
实施例4：临床验证(一)
样本：某疑似肝病患者血清，采用以上的u-plex方法检测il-31分子在该患者血清中的表达水平，经计算，il-31浓度为21.3pg/ml，高于临界值15.2pg/ml，提示该患者患有pbc，经查患者虽抗线粒体抗体阴性，但碱性磷酸酶368u/l，经肝组织学证实，患者确为pbc。
实施例5：临床验证(二)
样本：某pbc患者血清，采用以上的u-plex方法检测il-31分子在该患者血清中的表达水平，经计算，il-31浓度为20.9pg/ml，属于较高水平，经肝组织学证实患者确处于肝组织学1期。
由以上试验结果可知，通过采用u-plex方法检测il-31分子在疑似肝病患者血清中的表达量能有效诊断出pbc，并对pbc病情作出判断。显然，il-31分子与pbc有明显相关性，因此，以il-31分子作为生物标志物对其血清表达量进行检测能够较好地对pbc作出诊断和病情评估。相应的，其u-plex检测技术能用于制备pbc诊断的试剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。