本发明属于食品质量安全检测领域与农产品分析检验领域，特别涉及一种同步检测食用菌中麦角固醇与维生素d2的方法与应用。
背景技术
维生素d(vitamind,vd)是人类和动物不可或缺的一种维生素，是人体生长发育所需的一种类固醇激素，具有调节人体钙和磷代谢。目前，维生素d缺乏是一个普遍性的全球问题，中老年人群中维生素d缺乏和不足人群分别占69.2％和24.4％之多。医学研究表明vd缺乏还是罹患癌症、自发性免疫疾病、传染病、心血管疾病和精神疾病等常见多发疾患的危险因素。
食用菌富含多糖、多酚及甾醇等生物活性物质具有较高的食用价值与多种医疗保健功能，素有“山珍”之称，已被广泛认知为代替红色肉类的健康食品，联合国粮农组织和世界卫生组织曾经提出人类最佳的饮食结构是“一荤一素一菇”。研究发现大部分食用菌中维生素含量相对较低，却含有较高的麦角固醇(维生素的合成前体)，其中野生食用菌比栽培食用菌维生素d2的含量要高，紫外照射能够显著提高食用菌中维生素d2含量，是食用菌品质质量的标志之一，因此，获得高维生素d食用菌是研究高维生素功能性食品重要原材料的关键，如何提高食用菌食药价值与出口质量是产业转型升级的迫切需求。
常见检测麦角固醇和维生素d2的方法有液相色谱法、气相色谱法。目前文献建立的检测方法多为对单一成分麦角固醇或维生素d2进行检测，由于维生素d2由植物性的麦角固醇经紫外线照射得来，麦角固醇和维生素d2是同分异构体，两者同时存在食用菌或真菌中，不同品种的食用菌或真菌中含量差异较大，从我国现行食用菌有效国家标准33项中发现，其中通用检验、检测标准5项，仅涉及到食用菌灰分、杂质、总糖含量、粗蛋白含量、粗脂肪含量的测定，但同步检测麦角固醇和维生素d2未发现国家标准与发明专利，相关研究文献鲜有报导。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同步检测食用菌中麦角固醇与维生素d2的方法。
本发明的另一目的在于提供上述同步检测食用菌中麦角固醇与维生素d2的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种同步检测食用菌中麦角固醇与vd2的方法，包括如下步骤：
(1)超声皂化法提取：
将食用菌样品与碱金属溶液混合均匀，再加入有机溶剂进行超声提取，得到粗提液；利用萃取剂对粗提液进行萃取，旋转蒸发溶剂，最后用无水乙醇溶解并过滤，得到提取液样品；
(2)标准液的配制：
将麦角固醇和维生素d2标准品配制成至少三个浓度的麦角固醇和维生素d2混合液作为标准液；
(3)液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)测定
将步骤(2)中的各浓度梯度的标准液通过液相色谱-串联质谱法测定，以标准液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；然后在相同条件下将步骤(1)中得到的提取液样品通过液相色谱-串联质谱法测定，并将检测结果与标准工作曲线对照，计算出样品中麦角固醇和维生素d2的含量；
所述的液相色谱-串联质谱法中：在电喷雾质谱、正离子监测模式下，麦角固醇定性和定量离子对为母离子m/z＝379.3、特征子离子m/z＝253.4，维生素d2定性和定量离子对为母离子m/z＝397.4、特征子离子m/z＝271.4。
步骤(1)中所述的食用菌包括新鲜食用菌(食用菌鲜样)、干食用菌(食用菌干样)以及食用菌加工产品；优选为平菇、鲍鱼菇、白玉菇、木耳、银耳、香菇、竹荪、茶树菇等；更优选为香菇干粉。
步骤(1)中所述的碱金属溶液优选为koh溶液或naoh溶液；更优选浓度为20％(w/v)的koh溶液。
步骤(1)中所述的碱金属的用量优选为按每克(g)按干重计的食用菌配比8g碱金属计算。
步骤(1)中所述的异丙醇的用量优选为按每克(g)按干重计的食用菌配比20ml异丙醇计算。
步骤(1)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种。
步骤(1)中所述的超声提取的条件优选为功率500w、频率40khz。
步骤(1)中所述的超声提取的时间优选为1h。
步骤(1)中所述的萃取剂优选为石油醚，或含有抗氧化剂的石油醚。
所述的抗氧化剂优选为二丁基羟基甲苯(bht)。
所述的含有抗氧化剂的石油醚中抗氧化剂的浓度优选为5×10-4g/l。
步骤(1)中所述的萃取的次数优选为2次。
步骤(1)中所述的萃取优选为通过如下步骤实现：将萃取剂和粗提液混合，振荡后静置，取上层萃取液；下层水相再次加入萃取剂进行萃取，取上层萃取液；合并两次得到的上层萃取液，并用水洗至中性。
所述的静置的时间优选为10min。
步骤(1)中所述的过滤为采用0.45μm的过滤膜过滤。
步骤(2)中所述的标准液中麦角固醇的浓度范围为0.40～3.60mg/l，维生素d2的浓度范围为0.22～2.20mg/l。
步骤(2)中所述的标准液中麦角固醇的浓度/维生素d2的浓度配对如下：0.40mg/l/0.22mg/l、1.20mg/l/0.66mg/l、2.40mg/l/1.10mg/l、3.00mg/l/1.54mg/l、3.60mg/l/2.20mg/l。
步骤(3)中所述的液相色谱-串联质谱法中液相色谱所用到的色谱柱包括c8色谱柱和c18色谱柱；优选为c8色谱柱。
所述的c8色谱柱优选为agilentzorbarsbc8色谱柱。
步骤(3)中所述的液相色谱-串联质谱法中液相色谱的洗脱条件优选为：流动相：a为甲醇，b为水；梯度条件：0～2min10％a、90％b，2～3min100％a，3～5min90％a、10％b；流速：2.5ml/min。
步骤(3)中所述的液相色谱-串联质谱法中液相色谱的检测波长优选为270nm。
步骤(3)中所述的液相色谱-串联质谱法中的质谱的条件优选为：
离子源：电喷雾正离子模式(esi+)；
监测方式：多反应检测；
气帘气(cur)压力：137.9kpa；
雾化气(gs1)压力：310.3kpa；
辅助气(gs2)压力:413.7kpa；
离子源喷射电压(is):5500v；
离子源温度(tem):500℃；
离子源喷雾流速:5l/min；
麦角固醇定性和定量离子对分别为母离子m/z＝379.3，特征子离子m/z＝253.4；维生素d2定性和定量离子对分别为：母离子m/z＝397.4，特征子离子m/z＝271.4；
麦角固醇和维生素d2的碰撞能量分别为22ev、18ev；麦角固醇和维生素d2的源内碎裂电压均为100ev。
所述的同步检测食用菌中麦角固醇与维生素d2的方法在食品检测领域中的应用。
所述的食品包括食用菌鲜样、食用菌干样以及食用菌加工产品。
所述的食用菌包括平菇、鲍鱼菇、白玉菇、木耳、银耳、香菇、竹荪、茶树菇等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的检测方法适用于平菇、鲍鱼菇、白玉菇、木耳、银耳、香菇、竹荪、茶树菇等食用菌鲜样、干样和加工产品中麦角固醇与维生素d2的的检测，具有耗时短，适用范围广以及准确的特点，可适用于大批量食用菌样品检测。可为食用菌新有效成分的检测提供技术方法，并为食用菌样品的添加剂分析及健康价值评估提供准确的分析方法。
2、本发明中经方法学考察，麦角固醇和维生素d2的平均加标回收率范围为86.7％～102.4％，相对标准偏差分别为1.02％～4.13％。采用液质联用法和高压液相色谱法对采集的样品分别检测，两种检测方法的实验结果并无显著性差异(p＞0.05)，但液质联用法具有检测限更低、样品测试时间缩短的优势。
3、本发明的方法对于食用菌中有效成分的质量控制，促进活性成分检测标准的完善及与新产品研发具有重要理论价值与现实意义，为食用菌新产品质量标准及产品质量检测标准的制定奠定实验基础，为促进国际化食用菌标准体系建立与完善提供技术方法，为研究同分异构体的同步分析检测提供实验与理论依据。
附图说明
图1是麦角固醇和维生素d2标准溶液的mrm色谱图；其中，图a为麦角固醇标准溶液的mrm色谱图，图b为维生素d2标准溶液的mrm色谱图。
图2是麦角固醇和维生素d2一级质谱离子扫描图；其中，图a为麦角固醇的一级质谱离子扫描图，图b为维生素d2的一级质谱离子扫描图。
图3是麦角固醇和维生素d2的二级质谱离子图及其结构图；其中，图a为麦角固醇的二级质谱离子图及其结构图，图b为维生素d2的二级质谱离子图及其结构图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实施例中涉及到的仪器：api4000q-traplc/ms/ms型三重四级杆质谱液质联用仪(美国应用生物系统公司)，aglient1100型液相色谱仪(美国agilent公司)，sb25-12d超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，c8(agilentzorbarsb，15mm×2.1mm，3.5μm)色谱柱，c18柱(agilentzorbarsb，4.6mm×250mm，5μm)。
实施例中涉及到的试剂：麦角固醇标准品(sigma公司，cas：57-87-4，纯度＞98％)、维生素d2标准品(sigma公司，cas：50-14-16，纯度＞98％)。
本发明样品中麦角固醇及维生素d2的提取可以采用本领域中常规的超声皂化法提取，皂化液可为甲醇、乙醇或异丙醇，以及naoh、koh等，萃取剂可为石油醚等；其中，以异丙醇和koh为皂化液，石油醚为萃取剂的提取效果最好(以麦角固醇提取率为考察指标)。基于麦角固醇和维生素d2的易氧化不稳定，在萃取时，加入抗氧化剂，有利于麦角固醇和维生素d2的稳定。
在预实验中本发明发明人对c8色谱柱和c18色谱柱进行了比较，二者的分离能力相近，但是，同种组分在c8色谱柱出峰时间比在c18色谱柱的要短，也就是，c8色谱柱的效率更高。在实验中发现，单纯采用甲醇作为流动性，麦角固醇出峰慢且有拖尾现象，灵敏度较低，随着甲醇在流动相中的比例调整，以一定比例形成的甲醇-水溶液作为流动相，样品出峰时间短，峰型陡而尖锐。
实施例1液相色谱-串联质谱法同步测定香菇中麦角固醇和维生素d2的方法
1、超声皂化法提取样品中麦角固醇及维生素d2
精确称取0.5g香菇干粉(将市售香菇粉碎，过30目筛)于250ml锥形瓶中，加入20％(w/v)koh溶液20ml，充分混匀后再加入异丙醇10ml，在超声波震荡机(超声功率500w，频率40khz)中提取1h后，加入20ml石油醚(含10mg/l的bht1.0ml)作为萃取剂进行提取，由于麦角固醇及维生素d2易氧化不稳定，在提取溶剂石油醚中加入10mg/l的二丁基羟基甲苯(bht)1.0ml，振荡后静置10min，取上层萃取液，下层水相再加入20ml石油醚(含10mg/l的bht1.0ml)萃取，合并两次上层萃取液用水洗至中性，采用旋转蒸发器蒸干溶剂，无水乙醇定容至10ml获得提取液，经0.45μm膜过滤后上机测定。
2、标准溶液的配制
精确称取麦角固醇和维生素d2标准品，以无水乙醇为溶剂配制成含麦角固醇和维生素d2分别为0.40/0.22、1.20/0.66、2.40/1.10、3.00/1.54、3.60/2.20mg/l混合标准母液，以标准液上机分析。
3、lc-ms/ms液质联用法检测条件与结果
3.1液相色谱条件与结果：
选用c8(agilentzorbarsb，15mm×2.1mm，3.5μm)色谱柱；流动相:a为甲醇，b为水；流速：2.5ml/min；检测波长为270nm，柱温:25℃；进样量:10μl。梯度洗脱条件见表1所示。
表1液相色谱梯度洗脱条件
从图1中可知，麦角固醇与维生素d2色谱峰保留时间在c8色谱柱分别为4.49min和4.26min。图像清晰平稳，无明显其他杂峰的干扰，方法专属性及色谱行为特异性强。与标样出峰位点有较准确的对应这是由于三重串联四级杆工作流程上是典型空间上的串联质谱：第一质量分析器(q1)选择确定的质荷比离子进入碰撞池(q2)，被选择的离子在池里与碰撞气体碰撞后经cid产生的离子碎片被第2个质量分析器(q3)扫描分析。因此避免了液相色谱仅通过色谱峰的出峰时间来确定结果而导致误判的可能。
3.2质谱检测条件与结果：
纯化样品采用电喷雾正离子模式(esi+)电离及多反应(mrm)监测检测模式，当气帘气(cur)、雾化气(gs1)及辅助气(gs2)压力分别设定为137.9kpa、310.3kpa及413.7kpa时，以5500v离子源喷射电压(is)，500℃离子源温度(tem)，5l/min离子源喷雾流速为质谱条件进行串联质谱分析。
在电喷雾质谱、正离子监测模式下，麦角固醇和维生素d2一级质谱离子扫描图如图2a和2b所示，麦角固醇和维生素d2的特征母离子峰分别为379.3，397.4，质谱碎片见图3。
由于维生素d分子结构中多为烷烃和烯烃的组合，打碎后碎片离子较多，且难找到明显的特征离子对。为了防止相同碎片离子对检测两种物质的干扰，通过对选择不同的特征离子与母离子组成离子对进行定量分析与检测，选择m/z379.3→253.4作为麦角固醇定性和定量离子对，m/z397.4→271.4作为维生素d2定性和定量离子对。
表2麦角固醇和维生素d2质谱分析参数
注：标“*”为定量离子
3.3计算公式
将上述标准液进行lc-ms/ms测定，以麦角固醇或维生素d2峰面积比为纵坐标(y)，麦角固醇或维生素d2浓度作为横坐标(x)作标准曲线,回归处理,并确定此标准曲线在线性范围内的相关系数。以基线噪声3倍峰面积对应的样品检出浓度作为检出限(lod)，以10倍峰面积对应的样品检出浓度作为定量限(loq)，麦角固醇和维生素d2线性关系、检出限和定量限如表3所示。结果表明麦角固醇在0.40～3.60mg/l(相关系数r2＝0.9995)，维生素d20.22～2.20mg/l(相关系数r2＝0.9997)浓度范围内具有良好的线性关系。然后根据标准曲线计算麦角固醇和维生素d2含量(mg/g)。计算公式如下：
麦角固醇或维生素d2含量(mg/g)＝cvn/m；其中，
c：麦角固醇或维生素d2浓度(mg/ml)；
v：提取液体积(ml)；
n：稀释倍数；
m：样品干重(g)。
表3液-质联用方法同步检测麦角固醇和维生素d2线性关系、检出限和定量限
实施例2麦角固醇和维生素d2液-质联用同步检测方法学考察
1、方法的加标回收率
准确度衡量反应测定值与真值的接近程度，通过回收率实验来分析准确度。取已知麦角固醇和维生素d2含量的香菇样品，取高中低三个水平含量麦角固醇和维生素d2标准品进行加标回收试验，其中麦角固醇加标量分别是：1.120、2.400、5.000mg/g，维生素d2加标量分别是：0.0120、0.0240、0.1000mg/g。每一个含量水平做六次平行试验，结果如表4所示。从测定结果可知，麦角固醇和维生素d2加标回收率范围为86.7％～102.4％，平均回收率在95％以上，相对标准偏差分别为1.02％～4.13％。
表4回收率试验
2、方法的精密度试验
通过比较不同实验室在不同日期完成的各次检测结果来反映方法的精密度，以此反映不同操作时间引起的测量结果差异。本试验中，各配制高、中、低三种不同浓度的麦角固醇和维生素d2的标准溶液，按实施例1中色谱-质谱分析条件，连续测定三天及每天重复三次，分别进行日内及日间进样分析，测定日内相对标准差偏差、日间相对标准差，结果见表5所示。从结果可看出，麦角固醇和维生素d2日间相对标准偏差rsd分别2.50％～3.87％，1.67％～4.53％。结果3d内含量测定rsd都小于5％，表明该方法日内、日间精密度好，且麦角固醇和维生素d2稳定性较好。
表5麦角固醇和维生素d2精密度试验
注：n为检测次数。
实施例3高效液相色谱法和液质联用法同步检测香菇样品vd2与麦角固醇的差异
高效液相色谱法(hplc)的检测条件为：c18柱(agilentzorbarsb，4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇；检测波长：270nm；流速：1.5ml/min；柱温：30℃；进样量10μl。采用外标法按峰面积进行定量。hplc的线性关系和检出限和定量限如表6所示，说明液相色谱-串联质谱法(表3)比hplc具有更低的定量限和检出限。
表6hplc线性关系、检出限和定量限
实施例4不同批次香菇样品中的测定
选取四批香菇分别制备成样品溶液，每批香菇干粉重复制样检测六次，按照建立的试验方法对香菇样品进行测定，并用高效液相色谱法(hplc)作对比(检测条件同实施例3)，根据检测结果和相对标准方差，并用p值检验两种检测方法检测结果的差异性。样品中维生素d2和麦角固醇的测定结果如下表7和8所示。
表7不同批次香菇中麦角固醇定量分析结果
注：n为检测次数。
表8不同批次香菇中维生素d2定量分析结果
注：n为检测次数。
由表7和表8可知，两种方法检测结果差异并不显著(p＞0.05)，与hplc高效液相法相比，液质联用法具有如下优势，在检测效率方面，液质联用法可在5分钟之内检测完一个样品，而高效液相色谱法需要更长的时间，液相色谱-串联质谱法更加高效与快速；在液相色谱-串联质谱法中，通过分析二级质谱图碎片离子结构确定定性定量离子，以离子对结合液相色谱的分离作用对样品中麦角固醇和维生素d2定性定量分析，液相色谱-串联质谱法更加准确。参照gb/t5009.82-2016《食品中维生素a、d、e的测定》，液相色谱-串联质谱法有更低的定量限和检出限。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。