一种检测甲硝唑凝胶皮肤透过性的方法与流程

本发明涉及妇科疾病治疗及相关药物领域，具体涉及一种检测甲硝唑凝胶皮肤透过性的方法。

背景技术

细菌性阴道炎(bv)是一种由阴道加特纳菌和一些厌氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，引起的阴道分泌物增多，白带有鱼腥臭味及外阴瘙痒灼热的综合征。可分为嗜血杆菌性阴道炎、棒状杆菌阴道炎、厌氧菌性阴道病炎、加特纳菌性阴道炎等。

甲硝唑作为细菌性阴道病的最常用药物，临床接受程度很高；《2010年美国疾病控制中心阴道炎治疗指南》和中华医学会拟定的《细菌性阴道病诊治指南(草案)》首选方案均为甲硝唑；但口服或注射制剂副作用大，容易产生过敏性休克和神经系统疾病，患者耐受性差。制成外用的制剂则可使药物主要在用药的局部作用，药物动力学研究显示采用阴道凝胶制剂的患者甲硝唑血清浓度仅为口服制剂的2％，副作用小，疗效优于口服制剂，患者耐受性大大提高。

对于外用的凝胶制剂而言，有效成分的皮肤透过性如何决定了其疗效能否快速、充分地发挥，皮肤透过性是甲硝唑凝胶制剂效果的核心体现。目前，亟待建立一种便捷、高效、准确地检测甲硝唑凝胶制剂皮肤透过性的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种便捷、高效、准确检测甲硝唑凝胶皮肤透过性的方法。

具体而言，本发明提供的方法包括如下步骤：

(1)在测试皮肤的一侧表面均匀涂布甲硝唑凝胶供试品，另一侧表面与接收液接触，所述接收液为0.8～1％氯化钠水溶液；在31～33℃的恒温水浴环境中使供试品透过所述测试皮肤并进入接收液中；

(2)从所述接收液中定时取多组接收样品，取样后加入等量同温的接收液；

(3)将定时取样获得的各组接收样品分别注入高效液相色谱仪中，以甲硝唑作为对照品，采用外标法测定各组接收样品中甲硝唑的浓度；

(4)计算甲硝唑的累积透过量，并计算其是否符合零级动力学释放规律。

本发明提供的方法可采用本领域常见的透皮吸收仪以及高效色谱仪得以实现。

本发明所述测试皮肤优选为动物离体皮肤或人工皮肤膜。其中，所述动物离体皮肤具体可选用解剖生理特点与人体皮肤相近的动物皮肤；例如：小型猪皮肤(在实际检测时可选用巴马小型猪皮肤)，其对药物的渗透性接近人体皮肤，试验中取皮部位为猪腹部或背部。所述人工皮肤膜可选用strat-m人工皮肤膜，其作为一种人工合成聚合物膜，由美国emdmillipore公司生产，该膜具有多层构造，其结构形态与人体皮肤相似，且与人体皮肤的渗透系数相似。

本发明通过大量实践发现，在测试皮肤上涂布甲硝唑供试品时，以每平方厘米涂布0.2～0.3g(即0.2～0.3g/cm²)的涂布效果最佳，可以确保最终检测结果最为准确，重复性最高，误差值最小。

在体外透皮试验过程中，接收液的选择是十分重要的，常用的接收液有林格氏液和等渗的磷酸盐缓冲液等。药物穿透皮肤角质层后，一般迅速被真皮中丰富的毛细血管床移除，因此，所选用的介质应尽可能模拟这一生理现象。本发明的有效成分甲硝唑在浓度为0.8～1％的氯化钠水溶液、优选为0.9％的氯化钠水溶液(即生理盐水)中的溶解度大于1mg/ml，对于甲硝唑凝胶而言，0.9％氯化钠水溶液是一种最为经济、简便且模仿生理现象效果最佳的接收液。为了确保实验满足漏槽条件，本发明提供的方法要求所述供试品在测试皮肤上的涂抹质量与接收液的体积之比小于1mg/ml，优选小于0.5mg/ml。例如：实际应用中，可采用franz接收池时，franz接收池的体积为5ml，甲硝唑阴道凝胶涂抹量约为0.2g，计算得到最大接收浓度为0.3mg/ml，远小于甲硝唑在0.9％氯化钠水溶液的溶解度，满足试验的漏槽条件。

本发明对皮肤透过检测过程中的温度进行严格控制。本发明通过大量实践发现，将水浴温度控制在31～33℃的范围内，尤其是在32±0.1℃的环境温度下，可以确保甲硝唑具有最合理的透皮速率，所得结果准确性最高。

本发明所述定时取样的时间优选为分别于实验开始后0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小时取样，在上述时间点进行取样，可以最大程度地体现吸收效果，并利于后续数据处理。本发明所述实验开始的时间是指满足供试品涂抹完毕、测试皮肤未涂抹的一面与接收液接触且确保接收液的温度恒定在预期范围内等一系列必要条件得到满足的时间。

本发明提供的方法中，采用高效液相色谱仪检测接收样品中甲硝唑浓度的方法可参照中国药典2015年版甲硝唑凝胶含量测定项下色谱条件，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-甲醇(80：20)为流动相；检测波长为320nm。理论板数按甲硝唑峰计算不低于2000。

作为本发明的一种优选方案，所述方法包括以下具体步骤：

(1)将释放面积为0.5～0.8cm²的巴马小型猪离体皮肤固定于透皮吸收仪释放池一端，所述离体皮肤的角质层面向释放池，取甲硝唑凝胶供试品0.1～0.2g均匀涂布于所述离体皮肤的角质层上；

(2)调节透皮测试仪保温水槽中水的温度恒定在32℃±0.1℃，并打开磁力搅拌；将所述释放池固定于接收池上，接收池中加入4～6ml的0.9％氯化钠溶液作为接收液，确保所述离体皮肤未涂布供试品的一面与所述接收液接触；分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小时定时取样1ml，同时加入等量同温的接收液；

(3)将取样所得的接收样品过滤后，分别取50μl注入高效液相色谱仪，另取甲硝唑对照品适量，用所述接收液稀释制成55～65μg/ml的溶液用于离体皮肤透皮测定，外标法测定接收液中甲硝唑浓度；其中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为80：20的水-甲醇为流动相，检测波长为320nm；

(4)计算甲硝唑的累积透过量，并计算其是否符合零级动力学释放规律。

作为本发明的一种优选方案，所述方法包括以下具体步骤：

(1)将释放面积为0.5～0.8cm²的人工皮肤膜固定于透皮吸收仪释放池一端，所述人工皮肤膜的粗糙面面向释放池，取甲硝唑凝胶供试品0.1～0.2g均匀涂布于所述人工皮肤膜的粗糙面上；

(2)调节透皮测试仪保温水槽中水的温度恒定在32℃±0.1℃，并打开磁力搅拌；将所述释放池固定于接收池上，接收池中加入4～6ml的0.9％氯化钠溶液作为接收液，确保所述人工皮肤未涂布供试品的一面与所述接收液接触；分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小时定时取样1ml，同时加入等量同温的接收液；

(3)将取样所得的接收样品过滤后，分别取50μl注入高效液相色谱仪，另取甲硝唑对照品适量，用所述接收液稀释制成5～7μg/ml的溶液用于人工皮肤膜透皮测定，外标法测定接收液中甲硝唑浓度；其中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为80：20的水-甲醇为流动相，检测波长为320nm；

(4)计算甲硝唑的累积透过量，并计算其是否符合零级动力学释放规律。

本发明提供的方法通过测试供试品是否符合零级动力学释放规律以确认其是否符合基本质量要求，并通过计算供试品的累积透过量以确认其释放效率且可以用于比较不同产品之间的累计释放量以确定产品优劣。具体而言：

本发明提供的方法采用公式：qn＝(a样/a对)×c对×v+∑qi以计算供试品的累计透过量。其中，qn为不同时刻累计透过量(μg)，a样为接收液峰面积，a对为对照品溶液的峰面积，c对为对照品溶液的浓度(μg/ml)，v对应为接收液的体积，qi为第i次实测的透过量。

本发明提供的方法以时间(h)为横坐标、甲硝唑透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，确认供试品是否符合零级透皮规律。

本发明提供的检测方法便捷、高效、准确性高，可以用于工业化生产中评价甲硝唑凝胶的透皮吸收效果，继而用于评价甲硝唑凝胶的产品质量。

附图说明

图1为实验例1中甲硝唑对照品溶液的高效液相色谱图；

图2为实验例1中人工皮肤膜空白溶液的高效液相色谱图；

图3为实验例1中小型猪离体皮肤空白溶液的高效液相色谱图；

图4为实验例3中甲硝唑的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中采用的仪器包括：高效液相色谱仪：岛津lc-20at；透皮吸收仪：型号tt-6，天津市正通科技有限公司；匀浆机：fsh-2，金坛市杰瑞尔电器有限公司。

以下各实施例分别采用小型猪离体皮肤与人工皮肤膜对株洲千金药业股份有限公司生产的第20170410、20170414与20170522批自研产品以及市售购得的甲硝唑凝胶进行体外透皮试验。

实施例1

取株洲千金药业股份有限公司生产的处方筛选样品(批号：20161201)及上市原研样品(批号：kaau)，采用人工皮肤膜照如下体外透皮试验方法进行试验：

(1)将释放面积为0.6cm²的人工皮肤膜固定于透皮吸收仪释放池一端，所述人工皮肤膜的粗糙面面向释放池，取甲硝唑凝胶供试品0.15g均匀涂布于所述人工皮肤膜的粗糙面上；

(2)调节透皮测试仪保温水槽中水的温度恒定在32℃，并打开磁力搅拌；将所述释放池固定于接收池上，接收池中加入5ml的0.9％氯化钠溶液作为接收液，确保所述人工皮肤未涂布供试品的一面与所述接收液接触；分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小时定时取样1ml，同时加入等量同温的接收液；

(3)将取样所得的接收样品过滤后，分别取50μl注入高效液相色谱仪，另取甲硝唑对照品适量，用所述接收液稀释制成6μg/ml的溶液用于人工皮肤膜透皮测定，外标法测定接收液中甲硝唑浓度；其中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为80：20的水-甲醇为流动相，检测波长为320nm；

(4)按照如下公式计算药物的累积透过量q：qn＝(a样/a对)×c对×v+∑qi以计算供试品的累计透过量。其中，qn为不同时刻累计透过量(μg)，a样为接收液峰面积，a对为对照品溶液的峰面积，c对为对照品溶液的浓度(μg/ml)，v对应为接收液的体积，qi为第i次实测的透过量；

以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，计算甲硝唑是否符合零级动力学释放规律，如符合零级透皮规律，比较自研制剂与原研制剂的斜率。

结果如表1所示。

表1：自研样品及原研上市样品药物累积透过量测定结果表(n＝6)

结论，以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，自研制剂(20161201批)与参比制剂的r²值均大于0.98，符合零级透皮规律，自研制剂的斜率比参比制剂相近，说明自研制剂与参比制剂皮肤透过性能相当。

实施例2

取株洲千金药业股份有限公司生产的处方筛选样品(批号：20170410)及上市原研样品(批号：kaau)，采用与实施例1相同的方法进行试验。

结果如表2所示。

表2：自研样品及原研上市样品药物累积透过量测定结果表(n＝6)

结论：以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，自研制剂(20170410批)与参比制剂的r²值均大于0.98，符合零级透皮规律，自研制剂的斜率与参比制剂相近，说明自研制剂与参比制剂皮肤透过性能相当。

实施例3

取株洲千金药业股份有限公司生产的处方筛选样品(批号：20170414)及上市原研样品(批号：kaau)，采用与实施例1相同的方法进行试验。

结果如表3所示。

表3:自研样品及原研上市样品药物累积透过量测定结果表(n＝6)

结论：以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，自研制剂(批号20170414)与参比制剂的r²值均大于0.98，符合零级透皮规律，自研制剂的斜率与参比制剂相近，说明自研制剂与参比制剂皮肤透过性能相当。

实施例4

取株洲千金药业股份有限公司生产的处方筛选样品(批号：20170522)及上市原研样品(批号：kaau)，采用与实施例1相同的方法进行试验。

结果如表4所示。

表4:自研样品及原研上市样品药物累积透过量测定结果表(n＝6)

结论，以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，自研制剂(批号20170522)与参比制剂的r²值均大于0.98，符合零级透皮规律，自研制剂的斜率与参比制剂相近，说明自研制剂与参比制剂皮肤透过性能相当。

实施例5

取对株洲千金药业股份有限公司生产的处方筛选样品(批号：20170414)及上市原研样品(批号：kaau)，采用小型猪离体皮肤照如下体外透皮试验方法进行试验：

(1)将释放面积为0.6cm²的巴马小型猪离体皮肤固定于透皮吸收仪释放池一端，所述离体皮肤的角质层面向释放池，取甲硝唑凝胶供试品0.15g均匀涂布于所述离体皮肤的角质层上；

(2)调节透皮测试仪保温水槽中水的温度恒定在32℃，并打开磁力搅拌；将所述释放池固定于接收池上，接收池中加入5ml的0.9％氯化钠溶液作为接收液，确保所述离体皮肤未涂布供试品的一面与所述接收液接触；分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小时定时取样1ml，同时加入等量同温的接收液；

(3)将取样所得的接收样品过滤后，分别取50μl注入高效液相色谱仪，另取甲硝唑对照品适量，用所述接收液稀释制成60μg/ml的溶液用于离体皮肤透皮测定，外标法测定接收液中甲硝唑浓度；其中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为80：20的水-甲醇为流动相，检测波长为320nm；

(4)按照如下公式计算药物的累积透过量q：qn＝(a样/a对)×c对×v+∑qi以计算供试品的累计透过量。其中，qn为不同时刻累计透过量(μg)，a样为接收液峰面积，a对为对照品溶液的峰面积，c对为对照品溶液的浓度(μg/ml)，v对应为接收液的体积，qi为第i次实测的透过量；

以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，计算甲硝唑是否符合零级动力学释放规律，如符合零级透皮规律，比较自研制剂与原研制剂的斜率。

结果如表5所示。

表5：自研样品及原研上市样品药物累积透过量测定结果表(n＝6)

结论，以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，自研制剂(批号20170414)与参比制剂的r²值均大于0.98，符合零级透皮规律，自研制剂的斜率(36.477)比参比制剂(34.532)相近，略高5.6％，说明自研制剂与参比制剂皮肤透过性能相当。

实施例6

取对株洲千金药业股份有限公司生产的处方筛选样品(批号：20170522)及上市原研样品(批号：kaau)，采用与实施例6相同的方法进行试验。

结果如表6所示。

表6：自研样品及原研上市样品药物累积透过量测定结果表(n＝6)

结论:以时间(h)为横坐标，透过量(μg)为纵坐标，进行线性拟合，自研制剂(批号20170522)与参比制剂的r²值均大于0.99，符合零级透皮规律，自研制剂的斜率(26.994)比参比制剂(25.960)相近，略高于参比制剂4.0％，说明自研制剂与参比制剂皮肤透过性能相当。

实验例1：空白干扰实验

取小型猪离体皮肤或人工皮肤膜，均匀涂抹约0.15g不含有甲硝唑的空白凝胶基质，置透皮吸收试验装置中，以0.9％氯化钠溶液为接收液，与12小时取样1ml，精密量取50μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取甲硝唑对照品适量，用接收液稀释制成6μg/ml的溶液。结果如图1、图2以及图3所示。

由图1～图3的结果可知，在所采用的色谱条件下，甲硝唑保留时间在4.389min左右，峰形良好，空白基质无杂峰干扰，基线平稳。证明本发明提供的方法对甲硝唑具有较高的特异性。

实验例2：检测限与定量限

取甲硝唑对照品适量，用流动相制成浓度为2.4μg/ml的溶液，然后分别稀释50～500倍不等，按照上述实施例所述色谱条件进行测定，50μl进样，测得甲硝唑定量限为1.20ng(s/n≈10)，检测限为0.36ng(s/n≈3)。

实验例3：线性范围

精密称取甲硝唑对照品15.13mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml量瓶，加0.9％氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液1ml置100ml、50ml、25ml、10ml，量取5ml置10ml量瓶，加0.9％氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，各取上述溶液及对照品储备液50μl注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。结果见表7以及图4。

表7：甲硝唑线性关系表

以样品浓度为横坐标，主峰面积为纵坐标，求得线性回归方程为a＝165058×c+8590.7，γ＝0.9999。

由以上结果可知，在0.61μg/ml～60.52μg/ml范围内，甲硝唑浓度与主峰面积线性关系良好。

实验例4：仪器重复性

精密称取甲硝唑对照品15.13mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml量瓶，加0.9％氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，50μl注入液相色谱仪，连续进样6针，记录谱图与峰面积，结果见表8。

表8：仪器重复性试验结果

由以上结果可知，本方法的仪器重复性良好。

实验例5：溶液稳定性试验

取人工皮肤膜透皮试验12小时后的供试品溶液，静置，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时进样，结果见表9。

表9、溶液稳定性试验结果

由以上结果可知，供试品溶液的稳定性良好。

实验例6：测试皮肤回收率实验

1、小型猪离体皮肤回收率试验

精密称取甲硝唑对照品15.26mg，置25ml量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取对照品储备0.1ml、0.3ml、0.6ml置10ml量瓶，加空白凝胶离体皮肤12小时的接收液稀释至刻度，摇匀，过滤，制成含甲硝唑浓度分别为6、18、36μg/ml的样品溶液，共制备9份。另精密称取甲硝唑对照品约15mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别取样品溶液和对照品溶液50μl注入高效液相色谱仪，外标法测定浓度。结果见表10。

表10、小型猪离体皮肤回收率试验结果

由结果可知，本方法测定离体皮肤透过率的准确度良好。

2、人工皮肤膜回收率试验

精密称取甲硝唑对照品15.06mg，置25ml量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml量瓶，加0.9％氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备0.2ml、0.5ml、1ml置10ml量瓶，加空白凝胶人工皮肤膜12小时的接收液稀释至刻度，摇匀，过滤，制成含甲硝唑浓度分别为1.2、3.0、6.0μg/ml的样品溶液，共制备9份。另精密称取甲硝唑对照品约15mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml量瓶，加0.9％氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别取样品溶液和对照品溶液50μl注入高效液相色谱仪，外标法测定浓度。结果见表11。

表11、人工皮肤膜回收率试验结果

由结果可知，本方法测定人工皮肤透过率的准确度良好。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。