本发明涉及一种通过脱氧核糖核酸中的6ma丰度鉴定植物对温度胁迫的耐逆性的方法。
背景技术：
水稻原产于中国和印度。是世界主要粮食作物之一。中国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。栽培历史已有14000～18000年。为重要粮食作物；除食用颖果外，可制淀粉、酿酒、制醋，米糠可制糖、榨油、提取糠醛，供工业及医药用；稻秆为良好饲料及造纸原料和编织材料，谷芽和稻根可供药用。在胁迫因子中，温度是影响植物生长的主要因子。近年来，随着温室效应的加剧，全球气温上升，高温胁迫对包括水稻在内的世界主要粮食作物生产造成极大威胁，严重影响水稻产量。高温胁迫是由高温的强度和持续时间共同决定的。bjorkan和berry将高温胁迫划分为两类：一是持续时间较长的相对高于水稻适宜生长温度的高温胁迫，二是绝对高于水稻适宜生长温度的短期高温胁迫。孕穗期、抽穗扬花期、灌浆结实期是水稻高温敏感时期当温度升高到阈值水平并持续一定时间，会对水稻生长发育造成不可逆的伤害，表现出高温热害。孕穗期、抽穗扬花期、灌浆结实期是水稻对高温较敏感的时期，高温敏感时期遭受高温胁迫会导致水稻产量严重下降。水稻高温热害一般是指在水稻抽穗结实期，气温超过水稻正常生育温度上限，影响正常开花结实，造成空秕粒率上升而减产甚至绝收的一种农业气象灾害。不良温度的损害取决于水稻的不同生育时期，在发芽期能耐较高的温度，但种子、秧苗常因地面高温而受害。在营养生长时期，叶片会因为高温而发生“褪绿”。特别是幼穗期，是水稻一生中对温度反应最敏感的时期，高温将引起幼穗发育迟缓阻滞或数量减少。花期不受精主要是温度影响的，而且花药对温度非常敏感，是受开花时花药温度决定。适宜的温度是植物生长发育的必要条件，温度过高或过低都会对植物的生长产生有害的影响。低温对植物造成的伤害称寒害，高温对植物造成的伤害称热害。按照低温的程度和植物的受害状况，寒害又分为冻害和冷害。植物对低温的适应与抵抗能力称植物的抗寒性。植物对高温的适应与抵抗能力称植物的抗热性。在零度低温时，虽无结冰现象，但能引起喜温植物的生理障碍，使植物受伤甚至死亡。在我国，冷害主要发生在早春和晚秋季节，主要危害作用在作物的苗期和籽粒或果实成熟期。水稻、棉花、玉米和春播蔬菜的幼苗常遇到冰点以上低温的危害，造成烂籽、死苗或僵苗。正在长叶或开花的果树遇冷害时会引起大量落花，使结实率降低。冷害对各个时期的水稻会造成不同程度的影响，营养生长期遇低温将发生延迟型冷害。主要使稻株的出叶速度减慢,株高、叶龄指数、总根数、根长和有效分蘖数降低,叶色变淡,有效分蘖终止期和最高分蘖期延迟。低温延缓幼穗分化始期以至延迟抽穗,影响成熟和产量。此期如遇低温,主要影响水稻的正常抽穗、开花和成熟,是障碍型冷害发生的关键期。此外，低温将减少每穗枝梗分化数和粒数,并发生大量的不孕粒。抽穗开花期如遇低温,将使花粉发芽率下降,花药不开,颖壳开裂角度变小,甚至不能开裂等,影响正常受精,造成不育,空秕率明显增加。灌浆期临界温度为18℃,低于18℃将减慢籽粒干物质的灌浆速度,籽粒不能完好成熟。低温不仅降低水稻的结实率,而且能诱导稻瘟病的大面积流行,甚至造成部分地块绝产,严重影响水稻产量和农民的经济收益。水稻受高温或低温的侵害，是自然中难以避免的自然性灾害之一，发生机理及解决措施仍需要深入研究。技术实现要素：本发明的目的是提供通过脱氧核糖核酸中的6ma丰度鉴定植物对温度胁迫的耐逆性的方法。本发明提供了一种鉴定植物对温度胁迫的耐逆性的方法(方法甲)，包括如下步骤：待测植物进行热处理，分别于热处理前和热处理后取地上部分，得到热处理前生物样本和热处理后生物样本；分别检测热处理前生物样本和热处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值a；相对值a＝热处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷热处理前生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；热处理时间为24小时时相对值a高于2的植物为候选的耐高温胁迫的植物；热处理时间为36小时时相对值a高于3的植物为候选的耐高温胁迫的植物；热处理时间为45小时时相对值a高于4的植物为候选的耐高温胁迫的植物；待测植物进行低温处理，分别于低温处理前和低温处理后取地上部分，得到低温处理前生物样本和低温处理后生物样本；分别检测低温处理前生物样本和低温处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值b；相对值b＝低温处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；低温处理时间为9天时相对值b低于0.5的植物为候选的耐低温胁迫的植物。所述热处理为置于45℃环境中培养。所述低温处理为置于4℃环境中培养。所述植物为水稻。脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度为脱氧核糖核酸中的6ma丰度与da丰度的比值。本发明还提供了一种鉴定植物对温度胁迫的耐逆性的方法(方法乙)，包括如下步骤：待测植物进行热处理，分别于热处理前和热处理后取地上部分，得到热处理前生物样本和热处理后生物样本；分别检测热处理前生物样本和热处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值a；相对值a＝热处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷热处理前生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；相对值a高的植物对高温胁迫的耐逆性高于相对值a低的植物；待测植物进行低温处理，分别于低温处理前和低温处理后取地上部分，得到低温处理前生物样本和低温处理后生物样本；分别检测低温处理前生物样本和低温处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值b；相对值b＝低温处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；相对值b低的植物对低温胁迫的耐逆性高于相对值b高的植物。所述热处理为置于45℃环境中培养。所述低温处理为置于4℃环境中培养。所述植物为水稻。脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度为脱氧核糖核酸中的6ma丰度与da丰度的比值。本发明还提供了一种鉴定水稻对温度胁迫的耐逆性的方法(方法丙)，包括如下步骤：待测水稻和参照水稻分别进行热处理，分别于热处理前和热处理后取地上部分，得到热处理前待测水稻生物样本、热处理后待测水稻生物样本、热处理前参照水稻生物样本、热处理后参照水稻生物样本；分别检测各个生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值a；待测水稻相对值a＝热处理后待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷热处理前待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；参照水稻相对值a＝热处理后参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷热处理前参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；如果待测水稻相对值a大于参照水稻相对值a，待测水稻为候选的耐高温胁迫的水稻；待测水稻和参照水稻分别进行低温处理，分别于低温处理前和低温处理后取地上部分，得到低温处理前待测水稻生物样本、低温处理后待测水稻生物样本、低温处理前参照水稻生物样本、低温处理后参照水稻生物样本；分别检测各个生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值b；待测水稻相对值b＝低温处理后待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；参照水稻相对值b＝低温处理后参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；如果待测水稻相对值b小于参照水稻相对值b，待测水稻为候选的耐低温胁迫的水稻；所述参照水稻为日本晴或9311。所述热处理为置于40℃以上环境中培养24-45小时。所述热处理为置于45℃环境中培养36-45小时。所述低温处理为置于4℃环境中培养9天。所述低温处理为置于4℃环境中培养9天。脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度为脱氧核糖核酸中的6ma丰度与da丰度的比值。本发明还提供了一种鉴定水稻对温度胁迫的耐逆性的方法(方法丁)，包括如下步骤：待测水稻和参照水稻分别进行热处理，分别于热处理前和热处理后取地上部分，得到热处理前待测水稻生物样本、热处理后待测水稻生物样本、热处理前参照水稻生物样本、热处理后参照水稻生物样本；分别检测各个生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值a；待测水稻相对值a＝热处理后待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷热处理前待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；参照水稻相对值a＝热处理后参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷热处理前参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；如果待测水稻相对值a大于参照水稻相对值，待测水稻对高温胁迫的耐逆性高于参照水稻；待测水稻和参照水稻分别进行低温处理，分别于低温处理前和低温处理后取地上部分，得到低温处理前待测水稻生物样本、低温处理后待测水稻生物样本、低温处理前参照水稻生物样本、低温处理后参照水稻生物样本；分别检测各个生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值b；待测水稻相对值b＝低温处理后待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前待测水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；参照水稻相对值b＝低温处理后参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前参照水稻生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；如果待测水稻相对值b小于参照水稻相对值b，待测水稻对低温胁迫的耐逆性高于参照水稻；所述参照水稻为日本晴或9311。所述热处理为置于40℃以上环境中培养24-45小时。所述热处理为置于45℃环境中培养36-45小时。所述低温处理为置于4℃环境中培养9天。所述低温处理为置于4℃环境中培养9天。脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度为脱氧核糖核酸中的6ma丰度与da丰度的比值。本发明还保护用于检测水稻的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度的物质在鉴定水稻对温度胁迫的耐逆性中的应用。本发明还保护用于检测水稻的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度的物质在鉴定水稻对低温胁迫的耐逆性中的应用。本发明还保护一种鉴定植物对低温胁迫的耐逆性的方法，包括如下步骤：待测植物进行低温处理，分别于低温处理前和低温处理后取地上部分，得到低温处理前生物样本和低温处理后生物样本；分别检测低温处理前生物样本和低温处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度，计算相对值b；相对值b＝低温处理后生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度÷低温处理前生物样本的脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度；相对值b低的植物对低温胁迫的耐逆性高于相对值b高的植物。所述植物为水稻。所述热处理为置于40℃以上环境中培养24-45小时。所述热处理为置于45℃环境中培养36-45小时。所述低温处理为置于4℃环境中培养9天。所述低温处理为置于4℃环境中培养9天。脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度为脱氧核糖核酸中的6ma丰度与da丰度的比值。6ma代表n6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。da代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。以上任一所述方法中，检测脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度的方法包括如下步骤：(1)提取生物样本的dna，变性后进行单核苷酸制备，然后进行去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测，获得脱氧核糖核酸中6ma的丰度和da的丰度；检测6ma时，质谱中，m/z参数设置为266.1-150.1，cid参数设置为14；检测da时，质谱中，m/z参数设置为252.1-136.1，cid参数设置为10；液相色谱中，a相为乙腈,b相为0.1％(体积比)甲酸水溶液；液相色谱中，洗脱过程如下：第0-7min，a相占流动相的体积比由0线性上升至1％；第7-10.5min，a相占流动相的体积比由1％线性上升至6％；第10.5-15min，a相占流动相的体积比由6％线性上升至100％；第15-20min，a相占流动相的体积份数由100％线性下降至0；(3)6ma的丰度除以da的丰度，即为脱氧核糖核酸中的6ma相对丰度。所述方法中，变性条件为95℃、5min。所述方法中，单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中，核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mm、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mm、核酸酶p1含量为1u、磷酸二酯酶ⅰ含量为0.01u、乙酸钠浓度为0.1mm、zncl2浓度为0.0067mm，余量为水。所述方法中，单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。所述方法中，去磷酸化的方法为：完成单核苷酸制备后，在体系中加入10u碱性磷酸酶进行反应。所述方法中，去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。所述方法中，纯化单核苷酸的方法为：完成去磷酸化后，将体系加至10kd超滤管，13000rpm离心10min，收集滤液，即为上机样本。以上任一所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中：液相色谱的检测柱为thermoscientifichypersilgoldaqreversephasecolumn(100×2.1mm，1.9μm)；液相色谱的柱温为25℃；；液相色谱的流动相流速为0.3ml/min。以上任一所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中：在阳离子模式下运行；喷射流技术esi源的参数设置：干燥器温度50℃，干燥器流量11l/min，雾化器压力20psi，鞘气温度300℃，鞘气流量12l/min，毛细管电压1800v。以上任一所述液相色谱-质谱联用仪具体可为安捷伦1260液相色谱-g6400系列三级四极杆质谱联。本发明对于鉴定/筛选耐高温胁迫水稻和耐低温胁迫水稻具有重大的应用推广价值。附图说明图1为实施例2中的植株照片。图2为实施例2中，目标检测对象为6ma时，水稻9311的生物样本输出的峰型图。图3为实施例2中，目标检测对象为6ma时，水稻nip的生物样本输出的峰型图。图4为水稻9311和水稻nip的0时刻生物样本中6ma的相对丰度。图5为实施例2中生物样本的相对值。图6为实施例3中生物样本的相对值。图7为实施例4中的植株照片。图8为实施例4中，目标检测对象为6ma时，水稻nip的生物样本输出的峰型图。图9为实施例4中，目标检测对象为6ma时，水稻9311的生物样本输出的峰型图。图10为实施例4中生物样本的相对值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。籼稻品种93-11，又称水稻9311。粳稻品种日本晴，又称水稻nip。粳稻品种丽江新团黑谷，又称水稻黑谷。粳稻品种越光，又称水稻越光。籼稻品种irat109，又称水稻irat109。籼稻品种湘晚籼5号，又称水稻湘晚籼。籼稻品种岳晚籼3号，又称水稻岳晚籼。籼稻品种n22，又称水稻n22，为领域内通认的耐高温水稻。籼稻品种特青又称水稻特青。实施例1、检测脱氧核糖核酸中的6ma的相对丰度的方法一、制备上机样本1、制备dna样本提取dna，然后95℃变性5min，得到dna样本。2、取步骤1得到的dna样本，进行单核苷酸制备。反应体系为300μl。反应体系中，dna含量为500ng(由dna样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mm、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mm、核酸酶p1含量为1u、磷酸二酯酶ⅰ含量为0.01u、乙酸钠浓度为0.1mm、zncl2浓度为0.0067mm，余量为水。实施例中采用的具体腺苷脱氨酶抑制剂为ehmahydrochloride，sigma公司，货号e114。实施例中采用的具体抗氧化剂为去铁胺。实施例中采用的具体磷酸二酯酶ⅰ为蛇毒磷酸二酯酶ⅰ。反应条件：37℃、5小时。3、取步骤2的产物，进行去磷酸化。完成步骤2后，在体系中加入10u碱性磷酸酶进行反应。实施例中采用的具体碱性磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶(cip)，neb公司，货号m0290s。反应条件：37℃、1小时。4、取步骤3的产物，纯化单核苷酸。完成步骤3后，将体系加至10kd超滤管，13000rpm离心10min，收集滤液，即为上机样本。二、上机检测采用安捷伦1260液相色谱-g6400系列三级四极杆质谱联用仪对步骤一得到的上机样本进行检测。设置质谱中的m/z参数和cid参数。目标检测对象为6ma时，m/z参数设置为266.1-150.1，“cid”参数设置为14。目标检测对象为da时，m/z参数设置为252.1-136.1，“cid”参数设置为10。液相色谱的检测柱为thermoscientifichypersilgoldaqreversephasecolumn(100×2.1mm，1.9μm)。液相色谱的柱温为25℃。液相色谱的洗脱过程见表1。液相色谱的流动相中，a相为乙腈，b相为0.1％(体积比)甲酸水溶液。液相色谱的流动相流速为0.3ml/min。表1保留时间a相占流动相的体积比0-15.3min0-1％15.3-20min1-6％20-30min6-100％30-41min100-0％以第一个时间段为例，对表1进行示例性解释如下：第0-15.3min，a相占流动相的体积份数由0线性上升至1％。在阳离子模式下运行。喷射流技术esi源的参数设置：干燥器温度50℃，干燥器流量11l/min，雾化器压力20psi，鞘气温度300℃，鞘气流量12l/min，毛细管电压1800v。采用6ma标准品按照目标检测对象为6ma的方法进行检测，6ma标准品的峰值对应的保留时间为22.9min，如果样本中具有22.9±1min的峰值，可以判断该峰值对应的化合物为6ma。采用da标准品按照目标检测对象为da的方法进行检测，da标准品的峰值对应的保留时间为6.9min，如果样本中具有6.9±1min的峰值，可以判断该峰值对应的化合物为da。分别输出目标检测对象为6ma和da时上机样本的峰型图。6ma的相对丰度＝6ma相应的峰面积除以da相应的峰面积。实施例2、供试水稻材料：水稻9311和水稻nip。高温胁迫处理：将供试水稻植株(萌发2周的幼苗，处于营养生长时期)置于45℃环境中培养，分别于0时刻、24小时后和45小时后，取地上部分，即为生物样本。设置三个生物学重复，结果取平均值。按照实施例1的方法对生物样本进行检测。0时刻的植株照片见图1a。45小时后的植株照片见图1b。0时刻，水稻9311和水稻nip的生长状况无明显差异。45小时后，水稻9311的生长状况极其显著的优于水稻nip。目标检测对象为6ma时，水稻9311的生物样本输出的峰型图见图2,其中a为0时刻的生物样本，b为24小时后的生物样本，c为45小时后的生物样本。目标检测对象为6ma时，水稻nip的生物样本输出的峰型图见图3,其中a为0时刻的生物样本，b为24小时后的生物样本，c为45小时后的生物样本。图2和图3中，横坐标为保留时间(min)。计算每个生物样本中6ma的相对丰度。水稻9311的0时刻生物样本和水稻nip的0时刻生物样本中6ma的相对丰度见图4，无显著差异。以0时刻生物样本中6ma的相对丰度为1，计算24小时后的生物样本和45小时后的生物样本的相对值。结果见图5。45小时后，水稻9311的相对值为6，水稻nip的相对值为3.1。实施例3、供试水稻材料：水稻nip、水稻黑谷、水稻越光、水稻irat109、水稻9311、水稻湘晚籼、水稻岳晚籼、水稻n22、水稻特青。高温胁迫处理：将供试水稻植株(萌发2周的幼苗，处于营养生长时期)置于45℃环境中培养，分别于0时刻和36小时后，取地上部分，即为生物样本。设置三个生物学重复，结果取平均值。按照实施例1的方法对生物样本进行检测。计算每个生物样本中6ma的相对丰度。以0时刻生物样本中6ma的相对丰度为1，计算36小时后的生物样本的相对值。结果见图6。进行表型观察。相对值越高的水稻，表型观察中对高温胁迫的耐逆性越强。相对值高于水稻nip的水稻，表型观察中对高温胁迫的耐逆性均高于水稻nip。相对值低于水稻nip的水稻，表型观察中对高温胁迫的耐逆性均低于水稻nip。相对值高于水稻9311的水稻，表型观察中对高温胁迫的耐逆性均高于水稻9311。相对值低于水稻9311的水稻，表型观察中对高温胁迫的耐逆性均低于水稻9311。实施例4、供试水稻材料：水稻9311和水稻nip。低温胁迫处理：将供试水稻植株(萌发3周的幼苗，处于营养生长时期)置于4℃环境中培养，分别于0时刻、3天后和9天后，取地上部分，即为生物样本。设置三个生物学重复，结果取平均值。按照实施例1的方法对生物样本进行检测。0时刻的植株照片见图7a。9天后的植株照片见图7b。0时刻，水稻9311和水稻nip的生长状况无明显差异。9天后，水稻nip的生长状况极其显著的优于水稻9311。目标检测对象为6ma时，水稻nip的生物样本输出的峰型图见图8,其中a为0时刻的生物样本，b为3天后的生物样本，c为9天后的生物样本。目标检测对象为6ma时，水稻9311的生物样本输出的峰型图见图9,其中a为0时刻的生物样本，b为3天后的生物样本，c为9天后的生物样本。图8和图9中，横坐标为保留时间(min)。计算每个生物样本中6ma的相对丰度。以0时刻生物样本中6ma的相对丰度为1，计算3天后的生物样本和9天后的生物样本的相对值。结果见图10。水稻9311的9天后的生物样本的相对值为0.82，水稻nip的9天后的生物样本的相对值为0.45。当前第1页12