本发明涉及葡萄酒检测技术领域，特别是一种测定葡萄酒中环己基氨基磺酸钠的方法。
背景技术
环己基氨基磺酸钠俗称甜蜜素，是食品生产中常用的添加剂。易溶于水，是一种低热量人工合成甜味剂，不具有任何营养价值，但其甜度可达到蔗糖的30~40倍，同时兼备有水果风味，以其低廉的价格和远超白糖的甜度，被广泛应用于食品加工领域。但是消费者如果经常食用甜蜜素含量超标的饮料或其他食品，就会因摄入过量对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。为此我国《食品添加剂使用卫生标准》(gb2760)的规定中，对环己基氨基磺酸钠在不同食品中的添加剂有着严格的限量规定。
gb5009.97-2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》于2017年3月1日开始正式实施。该标准较以前的测定方法增加了第三法：液相色谱-质谱/质谱法。其检出限由0.010g/kg降低为0.03mg/kg，定量限由0.030g/kg降低为0.1mg/kg，检测精度增加300倍。
1、国标方法的试样溶液制备过程为：称取酒样10.0g，置于50ml烧杯中，于60℃水浴加热30min，残渣全部转移至100ml容量瓶中，用水定容并摇匀，经0.22um水相微孔滤膜过滤后备用。
2、上述国标方法的液相色谱梯度洗脱条件，如下表1所列：
按照该色谱条件，实际检测过程中，环己基氨基磺酸钠的保留时间超前，与葡萄酒中其它物质同时出峰，形成干扰，加标样品的回收率超出应用范围。采用上述国际色谱条件检测的环己基氨基磺酸钠的加标回收率超过100%±10%，影响检测结果的准确性。
鉴于以上所述现有技术中存在的不足，亟待解决的问题有：一是如何改善色谱条件使其达到较好的分离效果，进而提高检测精度。二是如何在保证检测精度的前提下，尽可能简化试样制备过程，使其简单快捷，适合大批量样品的快速测定，从而能够大幅提高葡萄酒行业或葡萄酒检测机构的检测效率。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种葡萄酒中环己基氨基磺酸钠的检测方法。
本发明采用的具体方案如下：
一种葡萄酒中环己基氨基磺酸钠的检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：
s1：样品提取
吸取待检葡萄酒样品，经0.22um滤膜过滤，作为待测定溶液；
s2：仪器准备
液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾（esi）离子源；
恒温水浴锅；
分析天平；
s3：试剂与材料
甲醇：色谱纯；
10mmol/l乙酸铵溶液的调配：称取0.78g优级纯乙酸铵，用水溶解至1000ml，加入乙酸将溶液ph值调整为5.3-5.4，摇匀后经0.22um滤膜过滤备用；
环己基氨基磺酸钠标准工作液的调配：称取0.01g环己基氨基磺酸钠标准品，用水溶解并稀释至100ml，摇匀后作为环己基氨基磺酸钠标准储备液：分别吸取适量体积的环己基氨基磺酸钠标准储备液，用与待检样品同类的葡萄酒进行稀释，配成三种浓度分别为0.02mg/l，0.1mg/l、1.0mg/l的环己基氨基磺酸钠标准工作液，使用前配置，三种标准工作液经0.22um滤膜过滤后备用；
s4：仪器检测条件
色谱柱：c18柱，1.8um，100mm×2.1mm；
流动相：甲醇、10mmol/l乙酸铵溶液；
流速：0.25ml/min；
进样量：10ul；
柱温：35℃；
梯度洗脱：液相色谱梯度洗脱条件见表2(后运行3min)；
扫描方试：质谱多反应监测（multipleresponsemonitoring，简称mrm）扫描，定性定量离子对及其它参考条件见表3；
s5：样品检测
调试液相色谱-质谱/质谱仪，使其满足s4所列的仪器检测条件，经检测得出以下结果：检出限和定量限均为0.01mg/l。
所述s5样品检测的具体过程为：调用环己基氨基磺酸钠检测方法，建立样品和标准品序列，运行方法，采集数据；调用数据建立校正表，线性相关系数应为0.999以上，存入方法；使用新建样品序列表，分析样品数据，根据物质保留时间和离子对，得出结果。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
本发明技术方案与现有同类产品或方法比较具有的优点或能够达到的有益技术效果：
1、前处理时间节省：方法去除了耗时，耗电的加热环节，直接用滤膜过滤。这样可节省大量的人力占用，而且单位时间内可处理的样品数量也增加。
2、前处理回收率增加：每多一步前处理步骤，必然造成目标物质的一定损失。而该方法不进行其它的操作，葡萄酒样品中的环己基氨基磺酸钠可以保证100%进入色谱-质谱系统进行检测，结果有保证。
3、检出限和定量限提高：该方法不进行任何稀释，在同等质谱条件下检出限由0.03mg/kg降低为0.01mg/kg，定量限由0.1mg/kg降低为0.01mg/kg，检测精度可增加10倍。
附图说明
图1：1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品根据国标gb5009.97方法的液相洗脱条件运行后的叠加色谱图；
图2：1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品洗脱梯度放缓运行后的叠加色谱图；
图3：采用甲醇:10mmol/乙酸铵溶液=5:95的条件进行匀速洗脱，1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品运行后的叠加色谱图；
图4：采用甲醇：10mmol/l乙酸铵溶液=10:90的条件进行匀速洗脱，1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品运行后的叠加色谱图；
图5：根据gb5009.97方法的液相洗脱条件，在运行结束后加5.0min的后运行平衡时间，1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品叠加色谱图；
图6：根据gb5009.97方法的液相洗脱条件，在运行结束后加3.0min的后运行平衡时间，1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品叠加色谱图；
图7：根据gb5009.97方法的液相洗脱条件，在运行结束后加1.0min的后运行平衡时间，1#样品甜蜜素水标样品与2#样品甜蜜素红酒标样品叠加色谱图；
图8：将1#与2#样品在甲醇：10mmol/l乙酸铵溶液=10:90的匀速洗脱条件、后运行3.0min及后运行1.0min三种条件下运行得到的色谱图叠加；
图9：使用酒空白作为溶液配制的标准品线性曲线图；
图10：含0.03mg/l甜蜜素的酒样运行8次的色谱图叠加图。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施方式，用来对本申请的检测方法及检测原理作进一步详细说明。
实施例1
一种葡萄酒中环己基氨基磺酸钠的检测方法，包括以下检测步骤：
s1：样品提取
称取待检葡萄酒样品，经0.22um滤膜过滤，作为待测定溶液；
s2：仪器准备
液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾（esi）离子源；
恒温水浴锅；
分析天平，感量0.1mg、0.1g；
s3：试剂与材料
甲醇：色谱纯；
10mmol/l乙酸铵溶液的调配：称取0.78g优级纯乙酸铵，用水溶解至1000ml，加入乙酸将溶液ph值调整为5.3-5.4，摇匀后经0.22um滤膜过滤备用；
环己基氨基磺酸钠标准工作液的调配：称取0.0100g环己基氨基磺酸钠标准品，用水溶解并稀释至100ml，摇匀后作为环己基氨基磺酸钠标准储备液：分别吸取适量体积的环己基氨基磺酸钠标准储备液，用与待检样品同类的葡萄酒进行稀释，配成三种浓度分别为0.02mg/l，0.1mg/l、1.0mg/l的环己基氨基磺酸钠标准工作液，使用前配置，三种标准工作液经0.22um滤膜过滤后备用；
s4：仪器检测条件
色谱柱：c18柱，1.8um，100mm×2.1mm；
流动相：甲醇、10mmol/l乙酸铵溶液；
流速：0.25ml/min；
进样量：10ul；
柱温：35℃；
梯度洗脱：液相色谱梯度洗脱条件见表2(后运行3min)；
扫描方试：mrm扫描，定性定量离子对及其它参考条件见表3；
s5：样品检测
调试液相色谱-质谱/质谱仪，使其满足s4所列的仪器检测条件，经检测得出以下结果：检出限和定量限均为0.001mg/l。
所述s5样品检测的具体过程为：调用环己基氨基磺酸钠检测方法，建立样品和标准品序列，运行方法，采集数据；调用数据建立校正表，线性相关系数应为0.999以上，存入方法；使用新建样品序列表，分析样品数据，根据物质保留时间和离子对，得出结果。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
甜蜜素的检测数据采集方法分为两部分，分别是液相色谱部分和质谱/质谱部分，其中质谱/质谱部分根据每台仪器的性能略有差别，可以通过调整参数的方式进行优化确定。液相色谱部分则需要根据物质在色谱柱上的表现，逐步探索优化。
以下列举几个实验验证过程及验证数据，用来对本发明技术效果进行支持。
实验例1
1#样品：0.1mg/l甜蜜素水标样品（用水做溶液配制）；
2#样品：0.1mg/l甜蜜素红酒标样品（用空白红酒做溶液配制）；
分别选取上述两个样品，作为方法确认的样品溶液，并将两个样品运行结束后的色谱图叠加方式的显示结果进行比较。
根据国标gb5009.97方法的液相洗脱条件，两个样品运行后的叠加色谱图见图1；
结果如表4所示。
结果显示：在原酒中加入甜蜜素标准品，由于原酒基质影响较大，最终的检测结果为0.17mg/l，已经严重失真。同时两个样品皆有一定的拖尾现象，保留时间也差别较大。所以根据gb5009.97方法检测甜蜜素需要进行样品的前处理，消除原酒基质的影响。
实验例2
将国标gb5009.97方法的洗脱梯度放缓，洗脱条件如表5所示，运行后的叠加色谱图见图2；
结果如表6所示：2#样品运行后同样由于原酒基质影响较大，最终的检测结果为0.14mg/l，与真实值相差较大。
实验例3
采用甲醇:10mmol/乙酸铵溶液=5:95的条件进行匀速洗脱，运行后的叠加色谱图见图3所示。
按照甲醇：10mmol/l乙酸铵溶液=5:95的匀速洗脱条件，1#和2#样品的运行结果比较见表7。
结果如表7所示：2#样品运行后最终的检测结果为0.10mg/l，定量较准确。但峰型有严重的拖尾，半峰宽较大。
实验例4
采用甲醇：10mmol/l乙酸铵溶液=10:90的条件进行匀速洗脱，运行后的叠加色谱图见图4所示。
结果如表8所示：2#样品运行后最终的检测结果为0.104mg/l，定量较准确。但峰型有拖尾，而且后期还要将基质中其它物质冲洗出色谱柱，需要较长时间，不利于大量样品的快速检测。
实验例5
根据gb5009.97方法的液相洗脱条件，如表2所示，在运行结束后加5.0min的后运行平衡时间，叠加色谱图如图5。
结果如表9所示：2#样品运行后最终的检测结果为0.103mg/l，定量较准确。但峰型有严重拖尾，半峰宽较大。
实验例6
根据gb5009.97方法的液相洗脱条件，如表2所示，在运行结束后加3.0min的后运行平衡时间，叠加色谱图如图6。
结果如表10所示：2#样品运行后最终的检测结果为0.106mg/l，定量较准确。但峰型有拖尾。
实验例7
根据gb5009.97方法的液相洗脱条件，如表2所示，在运行结束后加1.0min的后运行平衡时间，叠加色谱图如图7。
结果如表11所示：2#样品运行后最终的检测结果为0.102mg/l，定量较准确。但峰型有严重拖尾。
实验例8
选择液相洗脱方法
将1#与2#样品在甲醇：10mmol/l乙酸铵溶液=10:90的匀速洗脱条件、后运行3.0min及后运行1.0min三种条件下运行得到的色谱图进行叠加，如图8所示。
根据保留时间差别、峰型和半峰宽等方面的综合考量，决定采用gb5009.97方法液相洗脱梯度的基础上，增加3.0min的后运行平衡时间的条件，作为甜蜜素检测方法的液相色谱部分的运行条件。
实验例9
定量准确性及重复性验证
在选择液相洗脱条件的基础上，由表10可知，如果采用水作为溶液配制标准品系列梯度，酒样的定量结果并不理想，所以需要进一步排除酒中物质对甜蜜素检测的影响。
采用空白酒作为溶液配制标准品系列梯度，选取0.02mg/l,0.10mg/l,1.00mg/l三个浓度，结果如图9所示，线性相关系数r2=0.99999545，可以作为定量标准曲线使用。
随机选取四个浓度，配制酒样，每个样品运行两次，检测结果如表12所示。误差在±2%范围内，精密度（在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算数平均值之比）＜5%，符合gb5009.97-2016要求（＜10%）。
将同一样品连续运行8次，运行色谱图叠加显示，如图10所示，保留时间稳定，峰型及面积一致，该方法系统稳定，可作为葡萄酒中甜蜜素的检测方法使用。