本发明涉及生化检测设备
技术领域：
，尤其涉及一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测方法及试剂盒。
背景技术：
肌酸缺乏综合征(creatinedeficiencysyndromes，cds)是一组影响肌酸合成及转运的先天性遗传代谢性疾病，其生化特点为脑肌酸缺乏。临床表现为智力缺损、语言发育迟缓、孤独症、癫痫发作、肌张力减退、以锥体外系损害为主的运动障碍和行为问题等。cds可能是众多原因不明精神发育迟滞儿童的致病原因，早期诊断并给予肌酸治疗，可改善预后。肌酸缺乏综合征根据基因缺陷分为三种类型：精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(arginine：glycineamidinotransferase，agat)缺陷、胍基乙酸甲基转移酶(guanidinoacetatemethyltransferase，gamt)缺陷和肌酸转运蛋白slc6a8基因缺陷。gamt缺陷患者在尿、血浆、脑脊液、滤纸干血片样本中出现胍基乙酸增高，肌酸和肌酐减低，肌酸/肌酐比值不变，但胍基乙酸/肌酸比值明显增高。应用滤纸干血片样本测定胍基乙酸和肌酸及其比值可用于gamt缺陷的辅助诊断技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于串联质谱的干血片中胍基乙酸(gaa)和肌酸(cre)浓度的定量检测技术及试剂盒。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测方法，包括如下步骤：(1)制备内标品液：在内标品中加入纯水，混匀直至完全溶解，真空干燥制成内标品液；(2)制备工作液：采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液，之后将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液；(3)利用打孔器将空白滤纸片、质控品滤纸片打孔，放入v截底型96孔板中，之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液；将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育；(4)振荡结束后，取孵育溶液，采用串联质谱法检测样本中胍基乙酸和肌酸浓度。本发明的方法，所述步骤(1)中，内标品成分为d3-肌酸和d2-胍基乙酸。所述步骤(2)中，干血斑萃取液可以在非衍生化的情况下使用，或经衍生化处理，在干血斑萃取液中加入衍生化试剂3n盐酸正丁醇，37℃下衍生化30分钟，获得衍生化干血斑萃取液。用干血斑萃取液/衍生化干血斑萃取液按体积110倍稀释成工作液；稀释后内标品浓度为1μmol/l。所述的萃取液为体积含量50–90％甲醇水溶液。所述步骤(3)中，质控品包括低水平质控及高水平质控品，低水平质控品为3μmol/l胍基乙酸、50μmol/l肌酸；高水平质控品为8μmol/l胍基乙酸、300μmol/l肌酸。利用打孔器将空白滤纸片、质控品滤纸片打孔，放入v截底型96孔板中，之后在各孔中加入工作液，将密封的v截底型96孔板置于孵育振荡器内，在温度为45±5℃，振荡频率为650–750转/分的条件下，振荡孵育45分钟。所述步骤(4)中，通过多反应监控mrm模式检测，质谱条件见下表1：表1胍基乙酸和肌酸测定的质谱条件本发明还提供一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测试剂盒，包括：(1)萃取液：体积含量50–90％甲醇水溶液；(2)衍生化试剂：3n盐酸正丁醇；(3)复溶液：纯水；(4)内标品：d2-胍基乙酸和d3-肌酸，浓度比例为1:1～100μmol/l根据质谱仪的响应度减补；(5)干血片质控品：包括低水平质控及高水平质控品；低水平质控品为3μmol/l胍基乙酸、50μmol/l肌酸；高水平质控品为8μmol/l胍基乙酸、300μmol/l肌酸。本发明的方法采用串联质谱(ms/ms)技术，来实现对滤纸干血片中胍基乙酸和肌酸定量检测。本发明的检测原理如下：在已知浓度的相应内标品存在下，新生儿滤纸干血片中的胍基乙酸和肌酸被萃取液萃取，萃取样本经过非衍生化或衍生化处理后，经由进样器和微型泵进入到质谱仪的离子源，在这里形成带电均匀喷雾，离子被导入质谱第一级质量过滤器中，按质荷比大小而被分离后进入碰撞室，被碰撞激活解离，较小的子代离子随后被导入第二级的质量过滤器，在此按质荷比进行分离，而后送到检测器内通过多反应监控(mrm)等模式得到离子信号。每种分析物的信号强度与相应内标品的响应程度成正比例，从而计算出滤纸干血片中的分析物浓度。数据采集与分析处理由质谱仪系统内的软件自动执行。本发明的串联质谱法筛查新生儿滤纸干血片中胍基乙酸(gaa)和肌酸(cre)浓度的定量检测技术及试剂盒，可以使准确地检测各类型滤纸干血片中的胍基乙酸(gaa)和肌酸(cre)浓度，其结果能够有效筛查和诊断新生儿和儿童肌酸缺乏综合征，尤其是胍基乙酸(gaa)甲基转移酶(guanidinoacetatemethyltransferase，gamt)缺陷综合征的筛查和诊断。附图说明图1为本发明实施例的胍基乙酸检测的质谱图。图2为本发明实施例的肌酸检测的质谱图。图3为本发明实施例的胍基乙酸、胍基乙酸内标物和肌酸、肌酸内标物检测的质谱图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过具体实施例结合附图，对本发明进行详细说明。实施例中，滤纸干血片样本的采集方法参考《新生儿疾病筛查技术规范》中《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》。合格滤纸干血片标准如下：(1)每一样本至少3个血斑，且每个血斑直径均大于8毫米。(2)血滴自然渗透，滤纸正反面血斑一致。(3)血斑无污染。(4)血斑无渗血环。(5)有完整的干血斑片采集信息记录。实施例使用仪器：超高效液相色谱-串联质谱仪(watersacquityuplci-classivd/watersxevotq-divdsystem，usa)；微孔板振荡器(货号2000a011，质谱生物科技有限公司产品)；v截底型96孔板(货号2000f01，质谱生物科技有限公司)；v底型96孔板(货号2001f01，质谱生物科技有限公司)；1/8英寸(3.2mm)打孔器(货号2001a011，质谱生物科技有限公司产品)；试剂盒组分：(1)萃取液(体积含量50–90％甲醇水溶液)；(2)衍生化试剂：3n盐酸正丁醇；(3)复溶液：纯水；(4)内标品：d2-胍基乙酸和d3-肌酸，浓度比例为1:1～100μmol/l(根据质谱仪的响应度减补)。(5)干血片质控品：低水平质控及高水平质控品两种，其比例见下表2。表2质控品gaa和cre浓度比例表低水平质控品高水平质控品胍基乙酸(gaa)3μmol/l8μmol/l肌酸(cre)50μmol/l300μmol/l试剂盒组分各个包装在打开之前，应恢复到室温，以防止产生冷凝水。1.1准备内标准品溶液取纯水1.0ml，加入到内标品小瓶中进行复溶，将液体混匀，直到完全溶解，大约需要5分钟。必要时冰浴超声促溶30min。2℃～8℃条件下储存在密封的原装小瓶中，此溶液配制后可稳定保存30天。采用萃取液(含有1-100μmol/l内标品甲醇水(80:20)溶液)萃取待测干血片样品，获得干血斑萃取液；也可进一步对干血斑萃取液进行衍生化处理，在干血斑萃取液中加入衍生化试剂3n盐酸正丁醇，37℃下衍生化30分钟，获得衍生化干血斑萃取液；确保在制备日常工作溶液之前，所需的已复溶内标品液和干血斑萃取液已经平衡至室温。1.2准备日常工作溶液将复溶的内标品用非衍生化干血斑萃取液或衍生化干血斑萃取液按体积110倍稀释成日常工作液(即v内标品：v干血斑萃取液/衍生化干血斑萃取液体积比为1:109)。该溶液在24小时内稳定，随用随配。内标品的浓度值如下表3所示：表3内标品浓度值待测物试剂瓶加入量110倍稀释后浓度d3-肌酸0.11mmol1μmol/ld2-胍基乙酸0.11mmol1μmol/l当准备与质谱生物科技有限公司生产的《琥珀酰丙酮和多种氨基酸、肉碱测定试剂盒(串联质谱法)》(非衍生化法)一同使用时，建议将复溶的内标品液与琥珀酰丙酮-氨基酸复溶的内标液用非衍生化干血斑萃取液按体积110倍稀释成日常工作液。1.3打孔：取一块新的v截底型96孔板(质谱生物科技有限公司产品，货号：2000f01)，使用自动或手动打孔器将空白滤纸片(第1、2孔)、质控品(低水平质控，第3、4孔；高水平质控，第5、6孔)和待测滤纸干血片样本(第7孔以后)打孔(每块96孔板都要按此排列)，直径1/8英寸(约为3.2mm)，依次放入到洁净的v截底型96孔板中。1.4向以上各孔加入步骤1.2中预先配制好的日常工作液100μl。1.5用微孔板粘贴膜紧密覆盖整块v截底型96孔板，确保密封。1.6立即将严密封盖的v截底型96孔板置于孵育振荡器内，在温度为45℃(±5℃)，振荡频率为650–750转/分的条件下，振荡孵育45分钟。1.7转移萃取溶液：振荡结束后，从每孔中取出75μl溶液至对应孔位的v型96孔板中。1.8使用铝箔制微孔板封套紧密覆盖v型96孔板，将溶液挥发量降至最低。1.9将带有铝箔紧密覆盖的v型96孔板放入自动进样器中，确保放置到位。1.10启用ms/ms应用软件，建立工作列表，选择正确的数据采集方法，输入各质谱数据采集参数，参考阅读本批产品质量证书，改正本批次的各内标品浓度，启动检测。检测胍基乙酸和肌酸的质谱条件如表1所示。注：各数据检测的最佳条件需要在参考品监测下仔细验证。2.质量控制2.1使用自动或手动打孔器将空白滤纸、高水平质控品和低水平质控品及滤纸干血片样本(第7孔以后)打孔，直径约为3.2mm(1/8英寸)，依次放入到洁净的v截底型96孔板中。第1、2孔放入空白滤纸，第3、4孔放入低水平质控品，第5、6孔放入高水平质控品(建议每48孔按此排列此4孔)。2.2质控品和样本在同样状态下运行，质控品检测结果均应在质控品质量分析报告允许范围内。2.3若质控品的检测结果不在允许范围内，要检查质谱仪及相应的操作，检查质谱仪是否进行定期校准，是否需要维护。2.4各实验室需要建立完整的室内和室间质评体系，保障报告量值准确而且可以溯源。根据已经测试的数据，正常儿童及成年人的血浆中胍基乙酸和肌酸含量的参考值范围如下表4。表4正常人血浆中胍基乙酸和肌酸含量的参考值根据已发表的报道，初检值通常设置在胍基乙酸＞3.5μm(99.5％可信度)，但胍基乙酸＞6.0μm(99.9％可信度)时可减少假阳性误报。若初检和复查均高于正常参考值，则可以考虑进一步检查。如胍基乙酸均高于正常参考值时，则考虑最少2次大于3mm的滤纸干血片提取dna做基因检测等三级筛查，gamt缺陷综合征的确诊则需要结合临床考虑。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。当前第1页12