本发明涉及于食品安全技术领域，特别是涉及了基于3,4-二氯苯胺的测定甘蔗中敌草隆残留的方法。
背景技术
敌草隆(diuron)是一种取代脲类除草剂，可有效防除禾本科杂草、阔叶杂草和藻类，由于这种除草剂其药效不受地域、气候条件的限制，全国各地广泛应用于甘蔗、玉米、大豆等作物田间，由于敌草隆化学性质稳定，残留期长，在环境中持久存在，并具有一定的生物蓄积作用，对哺乳动物、鸟类及胎儿发育和人类健康有毒性作用，根据2015年5月24日颁布实施“食品安全国家标准食糖gb13104-2014”，将原有卫生标准上升为食品安全国家标准，增加了食品添加剂和污染物（如农药残留、重金属等）限量标准使用规定，其中分别执行gb2760-2014和gb2762-2017的最大残留量和最大使用量，因此为了保障糖品和环境安全，对敌草隆糖品原材料甘蔗汁的残留量进行分析非常必要。
目前，检测甘蔗中敌草隆的方法主要有酸水解气相色谱-质谱法、超高液相色谱法和液相色谱-质谱法等仪器分析方法。由于敌草隆当温度达到180℃以上产生分解，给气相色谱法定性和定量分析带来了困难，大多数研究采用液相色谱法进行分析，但当采用液相色谱-质谱法,检测成本高和流动相试剂消耗量大，均难以满足快速、低成本、环保检测要求。
技术实现要素：
为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供基于3,4-二氯苯胺的测定甘蔗中敌草隆残留的方法。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
基于3,4-二氯苯胺的测定甘蔗中敌草隆残留的方法，包括如下步骤：
s1.采用气相色谱-质谱联用技术确定敌草隆热分解的指示成分3,4-二氯苯胺；
s2.样品前处理：将甘蔗样品进行提取和净化处理，获得甘蔗待测液；
s3.配制至少6个浓度的敌草隆标准溶液；将配制的各浓度梯度的敌草隆标准溶液进行气相色谱-电子捕获检测器测定，以标准溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，绘制标准工作曲线；在相同条件下将甘蔗待测液注入气相色谱-电子捕获检测器进行测定，测得甘蔗待测液中敌草隆的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到甘蔗待测液中敌草隆含量。
进一步地，气相色谱-电子捕获检测器检测的条件为：色谱柱型号：rtx-5；色谱柱尺寸：30m×250μm×0.25μm；载气为纯度大于99.999％的氮气；载气流速为1.2ml/min；进样口温度为250℃；检测器温度为300℃；柱温箱采用程序升温，升温程序为：色谱柱初始温度100℃，以20℃/min升至200℃，再以8℃/min升至230℃，保持2min；进样量：1l；分流比为:1:50。
进一步地，步骤s1的具体操作为：（1）气相色谱条件的建立；质谱条件的建立；（2）对一定浓度的敌草隆标准溶液用气相色谱-质谱仪在步骤（1）的条件下进行检测，根据所得的总离子流色谱图和质谱图，结合美国nist标准图谱库或其它标准图谱库检索，对所述敌草隆标准溶液中各热分解物进行定性分析，确定敌草隆热分解的主要产物3,4-二氯苯胺；（3）配制不同浓度的敌草隆标准溶液，将配制的各浓度梯度的敌草隆标准溶液用气相色谱-质谱仪在步骤（1）的条件下进行检测，进行选择离子监测sim定量分析，定量离子为m/z161的离子，以敌草隆浓度为横坐标，以其定量离子的峰高为纵坐标，采用最小二乘法的线性回归来绘制标准工作曲线，该标准工作曲线的线性相关系数大于0.998。
由于敌草隆当温度达到180℃以上产生分解，给气相色谱法定性和定量分析带来了困难，本领域研究人员一直认为对甘蔗样品中敌草隆残留的检测不适用于采用气相色谱-电子捕获检测器法。本申请人通过长期深入研究，利用气相色谱-质谱联用技术对敌草隆在气相色谱分析过程中热分解所产生的分解产物进行了定性与定量研究，通过质谱图分解产物的化学结构，找出敌草隆热分解的指示成分及与敌草隆原液关系，确证了气相色谱-电子捕获器检测法测定甘蔗样品中敌草隆残留的可行性和准确性，对建立气相色谱-电子捕获检测器法分析甘蔗样品中敌草隆残留的检测方法具有重要意义。
迄今为止，未见国内外有关于食品农产品中气相色谱-电子捕获检测器法中将3,4-二氯苯胺作为敌草隆的定性及定量指标的报道，在本申请之前，本领域技术人员一直将研究的重点放在如何采用除气相色谱-电子捕获检测器法之外的仪器检测法高效测量敌草隆残留的研究上，因为敌草隆的热不稳定性，本领域技术人员一直未关注采用气相色谱-电子捕获检测器法测量敌草隆残留的可行性，本申请人经过深入研究，确定了3,4-二氯苯胺为敌草隆热分解的指示成分及定量分析的代表成分，而且3,4-二氯苯胺结构中含有两个电负性较强的氯元素在-电子捕获检测器中有较强的响应信号，灵敏度高，从而为快速检测痕量敌草隆提供了一种新的途径。
进一步地，气相色谱条件的建立：色谱柱型号：hp-5ms；色谱柱规格：30m×250μm×0.25μm；载气为纯度大于99.999％的氦气；载气流速为1.2ml/min；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃，柱温箱采用程序升温，升温程序：色谱柱初始温度100℃，以20℃/min升至200℃，再以8℃/min升至230℃，保持2min；进样量：1l，分流比为：1:5；质谱条件的建立：离子源：电子轰击源；电子能：70ev；气相色谱-质谱接口温度：250℃；四极杆温度：150℃；离子源温度：230℃，采集模式：选择离子监测sim，3,4-二氯苯胺的定量离子为m/z161的离子，定性离子为m/z161、207、126、63的离子。
甘蔗汁基质复杂，含有较多有机酸、酚类、金属离子、色素和微生物等，不仅会降低检测结果的灵敏度和选择性，而且还会对色谱柱、离子源和检测器等造成极大的损害。因此，在进行仪器分析前，通常需要采用合适的样品前处理技术避免基质对目标物分析的干扰，提高检测结果的准确性。
进一步地，样品前处理为：（1）提取：吸取蔗汁5.00ml置于50ml离心管中，加入5.0ml乙腈和2.0g柠檬酸钠，旋混1min，超声提取3min，将离心管放入离心机中以5000r/min离心5min，取出上清液至于氮吹管中；再向上述离心管中继续添加5.0ml乙腈，旋混1min，超声提取3min，将上述离心管放入离心机中以5000r/min离心5min，取出上清液至于上述氮吹管中，吹至近干，用甲醇定容至2.0ml，得提取液；（2）净化：将提取液转入净化柱中，反复抽推三次活塞，让提取液通过净化柱，得洗脱液；再将洗脱液通过0.22微米的微孔滤膜，转移至进样瓶中待上机测定。
进一步地，超声提取的频率为70khz，超声提取的温度为30℃。
本发明中采用乙腈为提取溶剂，相对于丙酮等常规使用的提取溶剂，不仅能够将甘蔗汁中的敌草隆最大程度地提取出来，而且由于甘蔗汁中含有大量的蔗糖、葡萄糖及果糖等糖类物质，这些成分不溶于乙腈中，采用乙腈作为提取溶剂，能有效降低糖类成分的干扰，使得目标物色谱峰形对称、基质效应低。
传统的提取过程中通常同时加入硫酸镁，本发明在实践中发现，以柠檬酸钠替代硫酸镁，可以大大提高了甘蔗汁中残留敌草隆的提取效率。
进一步地，所述净化柱包括柱管和柱管内的填料，所述柱管内设有一活塞，所述活塞可沿所述柱管的轴向移动；所述柱管下端设有出液管；所述的填料由下列组份组成：nano碳3-12份、改性介孔氧化硅2-10份和硅藻土0.5份；所述nano碳装填于柱管底层，所述改性介孔氧化硅和硅藻土混合装填在柱管上层，其间使用聚丙烯筛板作为分隔。
进一步地，所述改性介孔氧化硅的制备方法为：将有序介孔氧化硅在75-85℃下烘干8-10h，得到预处理后的有序介孔氧化硅；将得到的预处理后的有序介孔氧化硅，加入甲苯，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和γ-卤丙基三甲氧基硅烷，在油浴恒温加热磁力搅拌器中搅拌反应，反应结束后抽滤，用异丙醇清洗1-2h，干燥，其中有机介孔氧化硅和甲苯的质量体积比为8g:1l，有序介孔氧化硅、3-氨丙基三乙氧基硅烷和γ-卤丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为:8.5:0.6:1.5。
本发明采用的是3-氨丙基三乙氧基硅烷和γ-卤丙基三甲氧基硅烷将有机功能化基团引入到介孔氧化硅表面，合成一种新型功能化介孔氢化氧化硅，在合成过程中通过调节3-氨丙基三乙氧基硅烷和γ-卤丙基三甲氧基硅烷的添加比例，可对介孔氧化硅材料表面功能化程度进行有效调控，使得功能基团分布均匀，并保持介孔氧化硅材料的孔道有序度不被破坏。采用这种方法合成的改性介孔氧化硅作为净化吸附剂能有效去除提取液中的酚类物质，同时降低对目标物的吸附。
nano碳是以碳为基础的纳米材料其表面疏水、多孔和特有的π电子系等特性，容易和目标化合物π-π作用，因此nano碳可以有效降低或消除样品中的色素、脂肪、金属离子等基质对检测结果的影响，是一种理想的吸附剂和净化剂。本发明中的nano碳选自市售产品，本发明中的净化柱是以市售的来自agela品牌的cleanertnano碳净化柱为基础进行的改进。
硅藻土的吸附能力很强，本领域技术人员通常在净化甘蔗提取液时不采用硅藻土，以避免硅藻土对其中的农药残留进行吸附，从而影响对甘蔗中农药残留的准确测定。本发明中意外尝试了加入少量硅藻土作为吸附剂之一，与nano碳和改性介孔氧化硅配伍使用，发现并不影响农药残留的回收，相反最终净化效果非常突出。
本发明中，通过优化了十几种吸附材料的性能，首次使用nano碳、改性介孔氧化硅和硅藻土作为吸附剂，又通过优化三种材料的用量和配比，结合应用方法达到了对甘蔗提取液的净化要求，能最大程度地去除样品基质干扰物，能显著降低基质效应，不会吸附目标农药。
进一步地，所述填料的粒度范围在5μm-100μm之间。
进一步地，筛板为具有一定孔径的网格结构
进一步地，所述柱管为高密度聚乙烯材料或玻璃材料。
现有的净化柱中，要么是将所有吸附剂混合后进行装填，要么是将各种吸附剂分层进行装填，本发明中将改性介孔氧化硅和硅藻土混合装填后再与nano碳分层装填，试验证实这种装填方式的净化效果更好。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次确定了采用气相色谱-电子捕获法测定热不稳定性物质敌草隆残留的可行性，采用本发明的方法，敌草隆在0.01-5.0mg/l范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998，检出限为0.007mg/kg，敌草隆在甘蔗汁中的回收率为89.2%-111%，相对标准偏差为2.45%-6.57%，该方法的准确度和精密度均可满足农药残留分析的要求。
附图说明
图1为0.5mg/l的敌草隆标准溶液的gc-ecd色谱图；
图2为0.5mg/l的敌草隆标准溶液的总离子流色谱图；
图3为3,4-二氯苯胺的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1
确定气相色谱-电子捕获检测器法中敌草隆热分解的指示成分的方法，其步骤如下：
（1）气相色谱条件的建立：色谱柱型号：hp-5ms；色谱柱规格：30m×250μm×0.25μm；载气为纯度大于99.999％的氦气；载气流速为1.2ml/min；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃，柱温箱采用程序升温，升温程序：色谱柱初始温度100℃，以20℃/min升至200℃，再以8℃/min升至230℃，保持2min；进样量：1l，分流比为：1:5；质谱条件的建立：离子源：电子轰击源；电子能：70ev；气相色谱-质谱接口温度：250℃；四极杆温度：150℃；离子源温度：230℃，采集模式：选择离子监测sim，3,4-二氯苯胺的定量离子为m/z161的离子，定性离子为m/z161、207、126、63的离子；
（2）对一定浓度（0.5mg/l）的敌草隆标准溶液用气相色谱-质谱仪在步骤（1）的条件下进行检测，根据所得的总离子流色谱图和质谱图，结合美国nist标准图谱库或其它标准图谱库检索，对所述敌草隆标准溶液中各热分解物进行定性分析，确定敌草隆热分解的主要产物3,4-二氯苯胺；
参阅图1-3可知，对敌草隆标准溶液进行气相色谱检测时，未发现敌草隆原形，但同时有两种分解产物形成，通过总离子流色谱图和质谱图分析，敌草隆热分解的主要产物3,4-二氯苯胺。
（3）配制不同浓度的敌草隆标准溶液（0.01-5ppm），将配制的各浓度梯度的敌草隆标准溶液用气相色谱-质谱仪在步骤（1）的条件下进行检测，进行选择离子监测sim定量分析，定量离子为m/z161的离子，以敌草隆浓度为横坐标，以其定量离子的峰高为纵坐标，采用最小二乘法的线性回归来绘制标准工作曲线，结果发现3,4-二氯苯胺相应信号与敌草隆浓度成正比，该标准工作曲线的线性相关系数为0.9986。
实施例2
在实施例1的基础上，测定甘蔗中敌草隆残留的方法，包括如下步骤：
s1.样品前处理：将甘蔗样品进行提取和净化处理，获得甘蔗待测液；
s2.配制7个浓度的敌草隆标准溶液（0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0mg/l）；将配制的各浓度梯度的敌草隆标准溶液进行气相色谱-电子捕获检测器测定，以标准溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，绘制标准工作曲线；在相同条件下将甘蔗待测液注入气相色谱-电子捕获检测器进行测定，测得甘蔗待测液中敌草隆的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到甘蔗待测液中敌草隆含量。
其中，气相色谱-电子捕获检测器检测的条件为：色谱柱型号：rtx-5；色谱柱尺寸：30m×250μm×0.25μm；载气为纯度大于99.999％的氮气；载气流速为1.2ml/min；进样口温度为250℃；检测器温度为300℃；柱温箱采用程序升温，升温程序为：色谱柱初始温度100℃，以20℃/min升至200℃，再以8℃/min升至230℃，保持2min；进样量：1l；分流比为:1:50。
样品前处理为：（1）提取：吸取蔗汁5.00ml置于50ml离心管中，加入5.0ml乙腈和2.0g柠檬酸钠，旋混1min，超声提取3min，将离心管放入离心机中以5000r/min离心5min，取出上清液至于氮吹管中；再向上述离心管中继续添加5.0ml乙腈，旋混1min，超声提取3min，将上述离心管放入离心机中以5000r/min离心5min，取出上清液至于上述氮吹管中，吹至近干，用甲醇定容至2.0ml，得提取液；（2）净化：将提取液转入净化柱中，反复抽推三次活塞，让提取液通过净化柱，得洗脱液；再将洗脱液通过0.22微米的微孔滤膜，转移至进样瓶中待上机测定。其中，超声提取的频率为70khz，超声提取的温度为30℃。
所述净化柱包括柱管和柱管内的填料，所述柱管为高密度聚乙烯材料或玻璃材料，所述填料的粒度范围在5μm-100μm之间，所述柱管内设有一活塞，所述活塞可沿所述柱管的轴向移动；所述柱管下端设有出液管；所述的填料由下列组份组成：nano碳3-12份、改性介孔氧化硅2-10份和硅藻土0.5份；所述nano碳装填于柱管底层，所述改性介孔氧化硅和硅藻土混合装填在柱管上层，其间使用聚丙烯筛板作为分隔，筛板为具有一定孔径的网格结构，其中，所述改性介孔氧化硅的制备方法为：将有序介孔氧化硅在75-85℃下烘干8-10h，得到预处理后的有序介孔氧化硅；将得到的预处理后的有序介孔氧化硅，加入甲苯，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和γ-卤丙基三甲氧基硅烷，在油浴恒温加热磁力搅拌器中搅拌反应，反应结束后抽滤，用异丙醇清洗1-2h，干燥，其中有机介孔氧化硅和甲苯的质量体积比为8g:1l，有序介孔氧化硅、3-氨丙基三乙氧基硅烷和γ-卤丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为:8.5:0.6:1.5。
实施例3
精密度与加标回收率实验
采用不含敌草隆的甘蔗汁作为空白样品，每个样品分别做0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg的添加水平的回收率实验，每个添加水平做6份平行样，按照实施例2中的方法进行测定，求其平均回收率与相对标准偏差。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。