本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种高效液相色谱-质谱法测定棉花中褪黑素的方法。
背景技术
褪黑素(melatonin，mt)是一种吲哚类激素，化学名称为n-乙酰-5-甲氧基色胺，是一种广谱的生理调节剂。褪黑素主要来自于哺乳动物的松果体，被证实是目前已知的抗氧化作用最强的内源性白由基清除剂。其对睡眠、促进性腺发育和生理节奏具有重要作用。
除动物外，目前在大多数食用植物，部分菊科植物，药用植物以及一些植物种子中也发现了褪黑素的存在。其在植物中具有调节昼夜节律，光周期与生长发育的作用，此外对植物自身抵御冷害，光伤害，化学物质和重金属离子伤害的能力皆有提高作用。最新研究表明，褪黑素除了在植物生长发育及自然逆境下发挥作用外，还可以提高植物抵御疾病的能力。褪黑素在动物中的功能包括清除自由基、增强免疫力、抑制衰老等作用，其生理与药理功能的多样性得到了国内外学者的普遍重视，美国食品与药品管理局认可褪黑素作为普通膳食补充剂，中国卫生部则先后批准20余种含褪黑素产品作为改善睡眠的保健食品，全世界至今已经有数百万人长期服用。通过对植物材料中mt含量的提取与检测，可以评估相关食品的合理饮用量，为人们的健康饮食、功能保健食品的开发利用提供科学依据。
目前，测定褪黑素的方法主要有电化学分析法、免疫分析法、色谱法等，其中，电化学分析法和免疫分析法主要是针对人体血液或其他动物器官中的褪黑素检测，专门针对植物中褪黑素检测的参考方法较少；色谱法具有灵敏度高、准确度高等优点，在此基础上又延伸出高效液相色谱与荧光检测器联用法(hplc-fd)、高效液相色谱-质谱法(hplc-ms)等检测方法。这些方法应用的范围依据植物的种类、检测的精确度和特异性要求并不一致。hplc-fd是植物中褪黑素定量研究的常用方法，但其对仪器设备要求较高，且荧光检测结果易受到背景荧光、ph、检测温度、溶剂等条件的影响，对于与褪黑素结构相似的物质很难区分开；hplc-ms可以同时提供目标激素的保留时间以及分子结构信息，具有灵敏度高，适合多组分分析，可靠稳定等优点，可以实现定性和定量分析的同时完成。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种高效液相色谱-质谱法测定棉花中褪黑素的方法。该方法灵敏度高、专一性强、稳定性好，可以实现对棉花中的褪黑素进行快速、准确检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高效液相色谱-质谱法测定棉花中褪黑素的方法，包括：将棉花样品加液氮研磨成粉末，然后与提取溶剂混合，经超声提取后，以高效液相色谱-质谱法检测，采用外标法对褪黑素进行定量。
优选的，所述提取溶剂为甲醇。
优选的，棉花样品与提取溶剂加入量的比为1g:10ml。提取溶剂的加入量会直接影响目标成分的提取效果。若提取溶剂的加入量过少，混合物浓度大，萃取时易发生乳化现象，且液体粘度大，空化较难发生；若提取溶剂的加入量过大，则不利于提取后溶剂的回收，造成提取溶剂的浪费，不利于节能环保。本发明对提取溶剂的用量进行了优化考察，结果发现，棉花样品与提取溶剂加入量的比为1g:10ml时，能够取得最优的提取效果。
优选的，超声提取的条件为：超声功率250-300w，超声时间30min。超声功率和超声时间是影响超声提取效果的两个关键因素，其中，随着超声功率的增大，褪黑素的得率也随之增大，在达到较好的提取效果后继续增大超声功率，则褪黑素的提取率会逐渐下降，这主要是因为超声功率增大，超声作用增强，使空化泡的运动比较剧烈；但是随着超声功率的进一步增大，加速了提取液的流动，从而物料停留在超声场中的时间减少，破壁作用随之减弱，褪黑素的溶出速率减小，再加上功率越大产生的热效应越强，可能破坏褪黑素的结构，使得有效的褪黑素含量减少。本发明对超声功率和超声时间进行了优化，结果发现，当超声功率为250-300w，超声时间为30min时，能够尽可能多的将棉花样品中的褪黑素溶出，同时尽可能的减少能源的浪费。
进一步的，所述超声提取与高效液相色谱-质谱法检测之间还包括：以8000r/min离心10min，取上清液并用氮气吹干，将吹干的残余物质溶于5％甲醇水溶液制成备用溶液的步骤，以及采用甲醇和水激活c18柱，将备用溶液加进c18柱中，待完全流出后用5％甲醇水溶液冲洗c18柱，再用80％甲醇水溶液将吸附在c18柱中的褪黑素洗脱出来并过滤的步骤。超声提取后的提取液中会含有较多的杂质，通过上述激活后的c18柱的洗脱，可以对提取液进行有效的净化，方便后续的高效液相色谱和质谱检测。
优选的，高效液相色谱-质谱法检测的色谱条件为：采用c18柱；流动相由a相和b相组成，a相为0.1％甲酸水溶液，b相为甲醇；采用梯度洗脱。
进一步的，所述梯度洗脱的程序为：0-0.2min，a相＝90％；0.2-3min，a相递减至0％；3-6min，a相＝0％；6-8.1min，a相递增至90％；6.1-10min，a相＝90％。
流动相及洗脱程序的选择直接影响液相色谱的分离效果，本发明在试验过程中对多个流动相体系进行了试验，如乙腈-水、甲醇-水，结果发现，只有甲醇-水体系能将目标峰和别的杂质峰分开，其他的流动相体系都不能将目标峰分开，而且峰形较差。为进一步改善目标峰的分离度和峰形，本发明在流动相中加入了0.1％的甲酸，极大的改善了目标峰的峰形和分离度。同时，为了使褪黑素能够得到较好的分离，本发明采用梯度洗脱，并对洗脱程序进行多次优化，最终得到最优的梯度洗脱程序为：0-0.2min，a相＝90％；0.2-3min，a相递减至0％；3-6min，a相＝0％；6-8.1min，a相递增至90％；6.1-10min，a相＝90％，在该洗脱程序下能够在最短的时间内将褪黑素分离，与现有报道的洗脱程序相比，大大缩短了洗脱时间。
优选的，高效液相色谱-质谱法检测的质谱条件为：喷雾电压：3500v，鞘气：35arb，辅助气：10arb，雾化温度：275℃，离子传输管温度：325℃，检测离子：母离子为m/z233.152，子离子为m/z174.000、159.000和130.071。
本发明选择m/z233.152作为检测的母离子，m/z174.000、159.000和130.071作为子离子，上述碎片稳定、丰度大，提高了检测的灵敏度；与其他的母离子和子离子组合相比，采用本发明的母离子和子离子组合极大的提高了检测的灵敏度和稳定性。
进一步的，外标法对褪黑素进行定量的标准曲线为：y＝1.94458×107+5.0306×107x；其中，y代表峰面积，x代表褪黑素浓度。
本发明还对上述所选用的参数进行了方法学验证，其中包括验证进样的精密度、方法的重复性、溶液的稳定性、方法的线性及回收率。试验结果表明，本发明所选用的高效液相色谱-质谱法参数能够满足对棉花样品中褪黑素成分的检测分离要求。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次实现了对棉花中褪黑素的提取和检测，检测方法的灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠。
(2)本发明检测棉花中的褪黑素所得色谱峰能够在极短的时间内与其他组分色谱峰就能达到基线分离，峰形良好，能满足定性和定量要求。
附图说明
图1：棉花样品材料中褪黑素的出峰图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：高效液相色谱-质谱法测定棉花中的褪黑素
1.样品溶液制备：
将棉花(种植于山东农业大学试验基地)的叶片加液氮用研磨仪将其研磨成粉末，称取2g,置于20ml甲醇溶液中浸泡，充分振荡并超声30min,8000r/min离心10min，取上清液并用氮气吹干，将吹干的残余物质溶于2ml的5％甲醇水溶液，备用。
对c18柱进行激活处理，即先用10ml的甲醇，之后再用10ml纯净水来激活c18柱。
然后，将之前2ml备用溶液加进c18柱中，待完全流出后，再用10ml的5％甲醇水溶液冲洗c18柱干扰杂质，最后，用80％甲醇水溶液5ml将吸附在c18柱中的mt以较慢的流速洗脱出，洗脱液经0.22μm过滤网过滤以备上机检测。
2.标准工作液配制：
将褪黑素标准品(购自索莱宝，编号m8600)用甲醇溶解，制成系列浓度分别为0.1ng/μl、1.0ng/μl、2ng/μl的标样。
3.高效液相色谱-质谱测定：
吸取配制好的不同浓度的褪黑素标样7μl，进行hplc-ms分析，采用外标法建立褪黑素的标准曲线：y＝1.94458×107+5.0306×107x；r2＝1.0000；其中，y代表峰面积，x代表褪黑素浓度。
将制备的样品溶液7μl注入hplc-ms系统进行分离分析，测得样品的峰面积，代入标准曲线，测得样品中褪黑素的含量。
液相条件：
色谱柱：thermohypersilgoldc18色谱柱(2.1×100，3μm)；
柱温：35℃；
流动相：a:0.1％甲酸水，b:甲醇；
洗脱梯度：0-0.2min，a相＝90％；0.2-3min，a相递减至0％；3-6min，a相＝0％；6-8.1min，a相递增至90％；6.1-10min，a相＝90％；
进样体积：7μl。
质谱条件：
喷雾电压：3500v；
鞘气：35arb；
辅助气：10arb；
雾化温度：275℃；
离子传输管温度：325℃；
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。