血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯残留的测定方法与流程

本发明涉及分析化学领域，尤其是涉及血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯的测定方法。

背景技术：

血液透析器是一种用于治疗急慢性肾功能衰竭的医疗器械，由空心纤维、外壳、密封层和端盖组成。血液透析器两端是由医用聚氨酯胶黏剂密封并与外壳固定。二苯基甲烷-4,4-二异氰酸酯(mdi)或聚合的mdi为医用聚氨酯胶黏剂主体材料的一种，常用于血液透析器。mdi具有2个杂积累双键再加上芳环的吸电子效应使其化学性质非常活泼，极易与其他含活泼氢原子的化合物反应生成氨基甲酸酯结构。血液透析器在使用时密封层直接与人体血液接触，血液透析器密封层中游离的mdi与包含氨基、羟基和巯基蛋白质和缩氨酸反应，产生不同的半抗原-蛋白质复合体或抗原，从而诱发机体致敏反应，损坏免疫系统，还可能产生遗传毒性和生殖毒性。此外，mdi与血液接触后会迅速水解生成4,4-二氨基二苯甲烷(mda)，而mda有潜在的致癌性。血液透析器密封层mdi单体具有明显的安全风险，所以控制mdi单体残留是非常有必要的。目前尚无血液透析器mdi单体残留测定报道。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯残留的测定方法，该测定方法能够准确、灵敏、高效地测定血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯的残留量。

为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：

血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯残留的测定方法，包括下列步骤：

将有机溶剂和衍生剂、内标物混合，对血液透析器密封层进行浸提，获得样品供试液；所述内标物为1,5-萘二异氰酸酯，所述衍生剂为9-n-甲氨甲基蒽。

采用高效液相色谱-荧光-内标法检测所述样品供试液中的二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯的含量，进而计算出血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯的残留量；

所述检测的色谱条件为：

色谱柱：c18柱，

流速：1～2.5ml/min，

激发波长250-260nm，发射波长410-415nm，

柱温：20～30℃，

进样量：3～10μl，

流动相：乙腈、缓冲溶液和甲醇以30～100:0～60:0～15的体积比梯度洗脱，优选35～100:0～55:0～10的体积比，所述缓冲溶液为ph为2.0～2.5的无机盐缓冲液，优选ph2～2.3；

并且所述检测时标准溶液中加入所述衍生剂。

本发明测定方法的核心在于内标物、衍生剂以及色谱条件。相比传统检测方法，本发明所用的内标物和衍生剂检测二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯时灵敏度和准确度更高。

本发明用9-n-甲氨甲基蒽作衍生剂保护目标物，用1,5-萘二异氰酸酯作内标物减小误差对结果的影响以及提高回收率；采用高效液相色谱-荧光检测器，采用特定的流动相和固定相，才能将二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯从浸提液中有效分离出，并且保证目标物的衍生物与邻近色谱峰的分离度大于1.5，进而提高检测方法的准确度、精密度和高效性，且满足了方法验证过程中对专属性、线性、准确度、精密度等方面的要求，该方法对于血液透析器的研究开发、质量控制及产品监管都具有重要意义。

本发明中，流速可在1～2.5ml/min范围内任意选择，例如1ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min、2.0ml/min、2.2ml/min等。

本发明中，激发波长可在250-260nm范围内任意选择，例如250nm、251nm、252nm、255nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm等，发射波长可在410-415nm范围内任意选择，例如410nm、412nm、414nm、415nm等。

本发明中，柱温可在20～30℃范围内任意选择，例如20℃、22℃、25℃、27℃、29℃、30℃等。

本发明中，进样量可在5～20μl范围内任意选择，例如5μl、6μl、8μl、10μl、15μl、18μl、20μl等。

本发明采用梯度洗脱，乙腈/缓冲溶液的初始体积比可以为30:60:10，或者35:55:10，或者35:60:5等；终点体积比可以为30:60:10，或者35:55:10，等；初始体积比与终点体积相同，不同梯度下的流速可以相同或不同。

在以上范围内，各参数的优选范围如下。

优选地，所述高效液相色谱法的色谱柱为150mm×4.6mm×3.5μm的c18柱或等效色谱柱；

优选地，流速为1.5～2.0ml/min，

优选地，激发波长250-254nm，发射波长410-412nm，

优选地，柱温为：25～30℃，

优选地，进样量：5～10μl。

优选地，所述缓冲溶液由醋酸铵、醋酸和水组成，以定容1l的缓冲液为例，配制过程为：

精密称取1.54g醋酸铵于1l容量瓶中，用水溶解、稀释、定容，用醋酸调节ph至2.3。

本发明中，浸提的目的是充分提取出血液透析器的密封层残留的二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯，进而检测残留量，为血液透析器的安全性监控提供准确数据。因此，浸提时需浸提完全，需要进行极限浸提测试，确定浸提完全所需的条件，包括料液比、时间、重复次数等。

优选地，所述浸提的方法为：

将有机溶剂和衍生剂、内标物混合，对血液透析器密封层进行多次超声浸提，合并浸提液，即为样品供试液。

以1g密封层样品为例，优选的浸提过程是：精密称取供试样品1g(精确到0.01g)于棕色玻璃瓶，加入10ml二氯甲烷和1.0ml衍生试剂，密封，室温超声30min,取浸提液于另一瓶中，用二氯甲烷两次清洗剩余样品，将清洗液与浸提液合并。剩余样品残渣同上操作重复浸提衍生两次。将三次浸提液氮气浓缩至干，精密加入5.0ml衍生物溶剂，超生溶解，0.45μm滤膜过滤，采用高效液相-荧光法测定。

优选地，在所述合并浸提液之后，进行浓缩，之后用所述有机溶剂重溶。

以上操作一方面可以富集目标物，另一方面可以除去部分杂质。

优选地，每克所述密封层中衍生剂的加入量为255μg以上，优选260μg以上。

通常衍生剂的加入量应过量，但量过多也不利于准确检测，针对常规的血液透析器，每克密封层加入衍生剂255μg以上足够，优选260μg。

同样，优选地，每克所述密封层中内标物的加入量为0.9μg以上，优选0.93μg以上。

为了提高检测准确度，优选地，所述有机溶剂为卤代烷烃，优选c1～c3的卤代烷烃，优选二氯甲烷。

优选地，在所述浸提之前，将所述密封层切成碎块。

另外，为了减少杂质对测定的干扰，在获取样品供试液后，建议取部分溶液氮吹至干，然后用同样的有机溶剂重溶，如有必要还可以用滤膜(通常用0.45μm滤膜)过滤。

综合考虑样品的获取方法，优选的色谱条件如下：

色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm或等效柱；

流速：1.5～2.0ml/min；

激发波长：254nm，发射波长：412nm；

柱温：25℃；

进样量：5μl；

流动相：按照表1进行梯度洗脱。

表1梯度洗脱

采用本发明的方法检测血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯的残留量时，绘制标准曲线时浓度范围对准确度也有一定影响。

优选选取浓度为20ng/ml～2000ng/ml左右区间的标准样品绘制曲线。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)本发明的方法能够高效、准确、灵敏地测定血液透析器中二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯的残留，解决了取样难题以及高效分离的难题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1提供的供试品与标准品高效液相色谱对比图；

图2为实施例1提供的空白溶剂高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一、材料和试剂

材料：血液透析器(新华医疗器械有限公司)。

试剂：二氯甲烷、醋酸、醋酸铵、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、9-n-甲氨甲基蒽、二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯(4,4′-mdi)、1,5-萘二异氰酸酯高效液相-荧光色谱仪(购于安捷伦)、xbridgerpc18色谱柱(购于waters)、超音波切割刀、氮吹仪、ph计。

二、检测方法步骤

(1)溶液配制：配制实验过程中所需如下溶液

a、二苯基甲烷-4,4-二异氰酸酯系列标准溶液配制：

精密称取二苯基甲烷-4,4-二异氰酸酯标准品5.12mg于50ml棕色容量瓶，用二氯甲烷溶解、稀释、定容，得浓度为100μg/ml标准储备液，采用逐级稀释法分别配制浓度为20.3、50.75、101.5、203、507.5、1015、2030ng/ml标准溶液。标准溶液-20℃避光干燥储存；

b、1,5-萘二异氰酸酯(内标)溶液配制：

精密称取异氰酸1,5-萘二异氰酸酯4.78mg于50ml容量瓶，用二氯甲烷溶解、稀释、定容，得浓度为93.69μg/ml内标储备液，采用逐级稀释法配制浓度为0.9369μg/ml内标溶液。内标溶液-20℃避光干燥储存；

c、衍生试剂配制：

精密称取9-n-甲氨甲基蒽13.04mg于50ml棕色容量瓶，用二氯甲烷溶解、稀释、定容，得浓度为260.8μg/ml衍生化试剂溶液，避光保存，临用现配；

d、衍生物溶剂配制：

量取50mln,n-二甲基甲酰胺于100ml容量瓶中，加入40ml乙腈，用水定容；

e、缓冲溶液配制：

精密称取1.54g醋酸铵于1l容量瓶中，用水溶解、稀释、定容，用醋酸调节ph至2.3；

(2)色谱条件：根据供试液需要确定如下色谱条件

f、色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm或等效柱；

g、流速：见表2；

h、激发波长：254nm，发射波长：412nm；

i、柱温：25℃；

j、进样量：5ul；

k、流动相：a乙腈；b缓冲溶液；c甲醇，洗脱梯度见表2。

表2洗脱梯度表

(3)样品预处理：采用超音波切割刀将血液透析器密封层取下，将其切成小块作为供试样品；

(4)浸提方式研究：精密称取供试样品1g(精确到0.01g)于棕色玻璃瓶，加入10ml二氯甲烷和1.0ml衍生试剂，密封，室温超声30min,取浸提液于另一瓶中，用二氯甲烷两次清洗剩余样品，将清洗液与浸提液合并。剩余样品残渣同上操作重复浸提衍生两次。将三次浸提液氮气浓缩至干，分别精密加入5.0ml衍生物溶剂，超生溶解，0.45μm滤膜过滤，采用高效液相-荧光法测定；

(5)供试样品衍生浸提：称取供试样品1g(精确到0.01g)于棕色玻璃瓶中，加入10ml二氯甲烷、1.0ml衍生试剂和1.0ml内标溶液，密封，室温超声30min,取出浸提液于另一瓶中，剩余样品残渣同上操作重复浸提衍生两次。合并浸提液，氮气浓缩至干，精密移取5.0ml衍生物溶剂，超声溶解，0.45μm滤膜过滤，采用高效液相-荧光法测定；

(6)标准工作液配制：分别取7个棕色玻璃瓶中，标号为1-7#，精密移取10ml二氯甲烷、1.0ml衍生试剂、1.0ml内标溶液、依次精密移取浓度为20.3、50.75、101.5、203、507.5、1015、2030ng/ml标准溶液1.0ml，室温超声30min，氮气浓缩至干，精密移取5.0ml衍生物溶剂，超声溶解，0.45μm滤膜过滤，采用高效液相-荧光法测定；

(7)结果分析：采用保留时间进行定性分析，内标法进行定量分析。

极限浸提进行分次衍生浸提，当提4,4′-mdi衍生物峰面积小于第一次浸提4,4′-mdi衍生物峰面积的10％时，对供试品的衍生浸提达到极限浸提。由表3知第三次浸提4,4′-mdi衍生物峰面积小于第一次浸提4,4′-mdi衍生物峰面积的10％，三次衍生浸提对供试品达到极限浸提。所以，供试液制备时，对供试品中4,4′-mdi残留单体进行三次衍生浸提。

表3供试样品三次浸提4,4′-mdi衍生物峰面积

血液透析器供试样品衍生浸提4,4′-mdi定性分析,精密移取标准溶液1.00ml(203ng/ml)于棕色玻璃瓶中，加入10ml二氯甲烷、1.00ml内标、1ml衍生试剂，密封，室温超声30min,氮气浓缩至干，加入5ml衍生物溶剂，超生溶解，0.45μm滤膜过滤,取供试样品按照供试品衍生测定操作，通过比较4,4′-mdi、内标及供试样品衍生高效液相色谱图(图1)，对4,4′-mdi及内标进行定性分析，知4,4′-mdi、内标衍生物保留时间分别约为43.3min和32.3min。4,4′-mdi衍生物色谱峰与邻近色谱峰分离度r1＝1.72、内标衍生物色谱峰与邻近色谱峰分离度r2＝2.6、r3＝4.5，本实施例的方法中，4,4′-mdi衍生物色谱峰、内标衍生物色谱峰与邻近色谱峰分离度均大于1.5。

血液透析器供试样品衍生浸提4,4′-mdi定量分析，取供试样品12份按照供试品衍生测定操作，根据内标法由线性回归方程计算，测得供试品中4,4′-mdi残留总量为98.30ng/g-142.95ng/g，每套透析器密封层部分重量约为34g/套，每套血液透析器中4,4′-mdi残留量约为3.34μg/套-4.86μg/套。

方法验证

(1)专属性：精密移取10ml二氯甲烷、1.0ml衍生试剂于棕色玻璃瓶中，密封，室温超声30min，氮气浓缩至干，精密移取5.0ml衍生物溶剂，超声溶解，0.45μm滤膜过滤，按照色谱条件测定，空白溶剂高效液相色谱图见图2。结合供试品定性分析，4,4′-mdi衍生物色谱峰及内标衍生物色谱峰峰形良好且与邻近色谱峰分离度均大于1.5，衍生化试剂及空白溶剂对内标衍生物及4,4′-mdi衍生物测定均无干扰，表明本方法满足分析要求。

(2)标准工作溶液线性：根据高校液相-荧光色谱条件测定标准工作溶液，以4,4'-mdi浓度(μg/g)为横坐标，以4,4′-mdi衍生物峰面积(a)与内标衍生物峰面积(b)比为纵坐标(即以a/b为纵坐标)，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程y＝0.002x-0.0124，相关系数r＝0.9998，4,4′-mdi衍生在20-2000ng/ml范围内线性良好。

(3)精密度(重复性)：精密移取50.75、203、1015ng/ml对照品溶液1.00ml于棕色玻璃瓶中，加入10ml二氯甲烷和1.0ml衍生试剂，密封，室温超声30min,氮气浓缩至干，精密加入5.0ml衍生物溶剂，超生溶解，0.45μm滤膜过滤，按照高效液相色谱条件平行测定6次，相对标准偏差rsd为0.238％-1.252％(见表4)。由回收率实验对4,4′-mdi进行低、中、高3个水平回收率精密度测定，每个加标水平平行测定3次，相对标准偏差rsd为1.29％-4.76％(见表5)，表明本方法精密度良好。

表44,4′-mdi衍生物精密度试验结果

(4)回收率：以供试品为基质，分别对4,4′-mdi进行低、中、高3个水平添加回收率测定，每个加标水平平行测定3次,4,4′-mdi的平均回收率81.15％-94.69％(见表5)，表明方法的准确度达到分析要求。

表54,4′-mdi回收率和精密度结果(n＝3)

因此使用本方法血液透析器供试样品中mdi残留单体经二氯甲烷超声辅助萃取后，与9-n-甲氨基甲基蒽进行衍生反应，衍生物采用c18液相色谱柱分离，荧光检测器测定，能够准确、灵敏、高效地测定血液透析器mdi单体残留。本方法具有很大的方法优势。

实施例2

与实施例1的样品供试液、空白供试液的获取方式以及标准溶液的配制均相同，区别在于色谱检测条件不同：

色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm；

激发波长250nm，发射波长410nm；

柱温：2027℃；

进样量：10μl；

流动相：梯度洗脱如表6所示，缓冲溶液与实施例1相同。

表6梯度洗脱表

结果显示该方法也表现出：专属性好，特异性强，准确度高，精密度、线性良好，标准工作曲线相关系r均大于0.999，方法精密度相对标准方差rsd为0.45％-4.97％，低、中、高浓度平均回收率为77.63％-90.21％。

实施例3

与实施例1的样品供试液、空白供试液的获取方式以及标准溶液的配制均相同，区别在于色谱检测条件不同：

色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，3.5μm；

激发波长260nm，发射波长415nm；

柱温：30℃；

进样量：15μl；

流动相：梯度洗脱如表7所示，缓冲溶液与实施例1相同。

表7梯度洗脱表

结果显示该方法也表现出：专属性好，特异性强，准确度高，精密度、线性良好，标准工作曲线相关系r均大于0.999，方法精密度相对标准方差rsd为0.35％-4.96％，低、中、高浓度平均回收率为79.56％-93.22％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。