一、技术领域
本发明涉及一种检测植物中茉莉酸(ja)含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯(jas)总含量的酶联免疫吸附分析方法(elisa)，属于分析化学的研究领域。
二、背景技术
以茉莉酸(jasmonicacid,ja)和茉莉酸甲酯(methyljasmonate,meja)为典型代表的茉莉酸类植物激素(jasmonates,jas)是一种新型天然植物生长调节剂，具有广谱的生理效应，普遍存在于多种高等植物体内。作为天然的内源植物激素，ja和meja都可以控制信号转导和调节生长，具有在分子、细胞、器官和个体等水平调节植物生长发育的多种生理效应。通过茉莉酸类激素(jas)的响应转录因子的自身调节，jas在植物次生代谢物的积累中起着重要作用，这些次生代谢物是药物、食品添加剂和精细化学品的重要资源。此外，茉莉酸类激素(jas)被认为在生物和非生物防御反应中起着关键作用，也参与了一些病原体引起的防御反应。已有研究表明，茉莉酸类信号分子可作为环境信号分子有效地介导植物对病原菌、食草动物及非生物胁迫等的防御反应，诱导一系列防御基因的表达、防御反应化学物质的合成，并调节植物的“免疫”和应激反应。jas与其他植物信号分子的拮抗或协同相互作用可调节防御和应激响应基因表达，以响应生物和非生物胁迫。另外，茉莉酸类激素(jas)对子叶气孔发育具有一定的调控作用，其中子叶是促进植物与环境间气体、水汽交换的重要通道。因此，作为内源性信号分子，茉莉酸类激素(jas)生理效应在植物中极为复杂。
茉莉酸类激素(jas)还可以作为外源激素使用，也可以通过形态学和生理变化的形式发挥抑制或促进（诱导）的各种作用。大多数外源性的ja或meja是合成的，而后者很容易从香水行业获得，这无疑增加了jas的商业价值。据报道，外源性meja的应用可以大大提高植物的防御能力，使植物抗咀嚼昆虫的死亡率从80%降低到12%左右。外源jas也参与调控水果蔬菜的营养质量，包括调控番茄红素、花青素等一系列次生代谢物的含量。
但是，内源性jas对植物生长的确切机制和作用有待进一步的发现和验证。外源性jas引起的内源性jas的变化仍需探索，这对指导农业生产具有现实意义。然而，jas在植物体内含量（µg~ng/g鲜重）很低和周围杂质干扰很多，导致其分析方法的灵敏度受到限制。因此，建立一种特异性强、灵敏度高的内源性信号化合物测定方法具有重要的意义。随着分离和分析技术的发展，各种定性和定量分析方法在jas的分析方面得到了应用，包括放射免疫分析法(ria)、酶联免疫吸附分析法(elisa)、高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-质谱仪(gc/ms)、液相色谱-质谱联用法(lc/ms)、液相色谱-质谱联用法(lc/ms/ms)、超高效液相色谱-电喷雾-电离质谱联用法(uplc/esi-ms)等等。与常规仪器法相比，免疫分析法价格低廉、操作简单、方法灵敏，仅需要少量植物样品，而且它有很强的抗干扰能力。
酶联免疫吸附分析方法(elisa)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，已经广泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。到目前为止，有关植物中茉莉酸类激素的免疫分析方法的论文很少，也只有为数不多的仪器方法可做到同时检测植物中茉莉酸和茉莉酸甲酯。本方法建立了高灵敏高特异测定植物中茉莉酸含量以及茉莉酸与茉莉酸甲酯总含量的以单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附分析方法(elisa)，为茉莉酸类植物激素的进一步研究奠定了坚实的基础。
三、
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定植物中ja含量以及ja与meja总含量(jas)的单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附分析方法(elisa)，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。
测定植物中ja含量以及ja与meja总含量(jas)的单克隆酶联免疫吸附分析方法。
（1）免疫原和包被抗原的制备
由于茉莉酸分子上有羧基，故可通过碳二亚胺法直接将茉莉酸与载体蛋白相连。将茉莉酸(ja)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，二环己基碳二亚胺(dcc)一同溶于二甲基甲酰胺中(dmf)，充分活化，低温离心取上层清液。后将上清缓慢加入到牛血清白蛋白即bsa或卵清白蛋白即ova中，充分反应后，离心取上层清液，透析，冷冻干燥，保存待用。投料比n(ja)=n(nhs)=n(dcc)，小分子与载体蛋白的比值在20~70。其中，ja-bsa为免疫原，ja-ova为包被抗原。
（2）单克隆抗体的制备
免疫：第一次免疫，将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的福氏完全佐剂混合，皮下多点免疫balb/c小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50~100μg；两周后第二次免疫，将福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂，其余步骤相同；两周后第三次免疫，重复第二次免疫操作，后一周，尾部取血elisa检测抗血清效价；取血两周后第四次免疫，重复第三次免疫步骤并取血测效价；取血两周后最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。
融合：腹腔加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞（sp2/0）按5:1~10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用hat培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37℃，5%co2培养箱中培养。
筛选：融合后2周左右，用间接elisa法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测。
单克隆抗体的大量生产：腹腔注射福氏不完全佐剂致敏balb/c小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水。多次离心取澄清腹水即作为单克隆抗体，单抗与甘油以及磷酸缓冲溶液(pb)4：5：1混合并置于-20℃保存。
（3）建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(elisa)
优化多个实验条件，在最佳条件的基础上，绘制出标准曲线。结果表明，该单克隆抗体对茉莉酸甲酯(meja)的特异性以及灵敏度(ic50)优于对茉莉酸(ja)。在此发现上建立了以单克隆抗体为基础以茉莉酸甲酯(meja)为实际检测对象的酶联免疫吸附分析方法(elisa)。
（4）elisa对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定
①样品提取方法
本发明根据检测目标物的不同设计了两种不同的样品提取方法，分别用于检测植物样品中的茉莉酸含量（ja）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（jas）。
检测植物中茉莉酸含量（ja）的提取方法：参考ny/t2871-2015方法并稍作修改。新鲜植物材料(0.5g)剪碎后于2ml预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时。（然后加入一定的ja标准溶液，形成一系列加标样品。）离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时。再次离心取上清，合并上清液，用甲酸调节ph至2.5-3.0，后上sep-pakc18小柱(waters,milford,usa)。上柱前用2ml20%甲醇水溶液（甲醇-水：20-80，v/v）活化平衡小柱。上样后按以下步骤：①用2ml1%甲酸水溶液（1ml甲酸加水至100ml）淋洗；②用2ml甲醇淋洗；③用2ml0.5%氨水甲醇（0.5mlnh4oh加甲醇至100ml）洗脱两次，收集洗脱液。洗脱液中加入重氮甲烷将提取物茉莉酸（ja）甲基化10分钟获得茉莉酸甲酯（meja）。然后将其均分成两部分，分别用于elisa和hplc分析。室温下氮气吹干。其中一份复溶于0.2ml甲醇，再用pbs稀释，用于elisa；另一份用1ml甲醇复溶，直接用于hplc分析。
检测植物中茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（jas）的提取方法：新鲜植物材料(0.5g)剪碎后于2ml预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时。离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时。再次离心取上清，合并上清液。提取液中加入重氮甲烷将提取物中的茉莉酸（ja）甲基化10分钟使得其中茉莉酸和茉莉酸甲酯均以茉莉酸甲酯（meja）的形式存在。然后将其均分成两部分，分别用于elisa和hplc分析。室温下氮气吹干。其中一份复溶于0.2ml甲醇，再用pbs稀释，用于elisa；另一份用1ml甲醇复溶，直接用于hplc分析。
hplc测定条件为：色谱条件:c18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈：0.2%三乙胺水溶液（用磷酸调节ph至4）=60:40（v/v）；流速为0.8ml/min；进样量为10μl；紫外检测波长为210nm；柱箱温度为35℃；在10分钟左右出峰。
②实际样品的检测并与hplc比较
选择了一系列样品，根据两种样品提取方法，分别对植物中茉莉酸含量（ja）和茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（jas）进行测定。并将elisa结果与hplc进行比较。
③加标回收实验
为了进一步证明本方法的实用性和准确性，本发明进行了一系列加标实验，检测茉莉酸（ja）的加标回收率。加标回收结果与hplc进行对比。
本发明的优点：
1、成功制备出抗ja的单克隆抗体，同时发现该抗体对meja检测灵敏度更高，并建立出直接测定样品中ja含量和jas总含量的elisa方法，无须借助仪器分析，这在国内、国外均属于首次。
2、灵敏度高。
3、样品处理简单、测试量大、测试费用低。
4、对样品的测定，elisa与hplc有很好的相关性。
四、附图说明
图1.免疫原和包被原的maldi-tof谱图
a.ova和ja-ova的maldi-tof谱图
b.bsa和ja-bsa的maldi-tof谱图
由图1a可知，ova的m/z是45196.289，ja-ova的m/z是49551.239，其差值除以ja的分子量，得到ja:ova=21:1；由图1b可知，bsa的m/z是66592.766;ja-bsa的m/z是72991.108，其差值除以ja的分子量，得到ja:bsa=30:1
图2.基于单克隆抗体建立的以meja为分析物的elisa标准曲线。
由标准曲线可知ic50和lod分别为2.02ngml-1and0.20ngml-1。
图3茉莉酸甲酯以及交叉物结构。
由图3和表1可知，该抗体对茉莉酸甲酯的特异性高于对茉莉酸，因此本实验的将茉莉酸转化为茉莉酸甲酯的方法是可行的。虽然它对二氢茉莉酸甲酯具有很高的特异性，但是该物质多为人工合成，植物体内发现的很少，因此可不考虑二氢茉莉酸对结果的影响。此外，该抗体对其他物质几乎没有响应。
图4.为加标实验中elisa和hplc检测结果的相关曲线。
由图4得知，所建立的elisa与hplc相关性较好，回归曲线为y=1.346x-1.360(r2=0.997,n=7)。
五、具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例：
（1）免疫原和包被抗原的制备
分别将12.22mg(0.0581mmol)茉莉酸（ja），6.69mg(0.0581mmol)n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），11.98mg(0.0581mmol)二环己基碳二亚胺（dcc）溶于100~200μl二甲基甲酰胺中（dmf），随后室温下边搅拌边将nhs,dcc溶液依次加入到ja溶液中，室温下搅拌过夜，将混合液4℃离心10分钟，取上层清液。后将上清缓慢加入到5ml的100mg牛血清白蛋白即bsa（或卵清白蛋白即ova）的nahco3缓冲液中，搅拌1~10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱-20℃中存放，其中，ja-bsa为免疫原，ja-ova为包被抗原。表征结果见图1。
（2）单克隆抗体的制备
免疫：第一次免疫，将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的福氏完全佐剂混合，皮下多点免疫balb/c小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50~100μg；两周后第二次免疫，将福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂，其余步骤相同；两周后第三次免疫，重复第二次免疫操作，后一周，尾部取血elisa检测抗血清效价；取血两周后第四次免疫，重复第三次免疫步骤并取血测效价；取血两周后最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。
融合：腹腔加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞（sp2/0）按5:1~10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用hat培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37℃，5%co2培养箱中培养。
筛选：融合后2周左右，用间接elisa法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测。
单克隆抗体的大量生产：腹腔注射福氏不完全佐剂致敏balb/c小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水。多次离心取澄清腹水即作为单克隆抗体，单抗与甘油以及磷酸缓冲溶液（pb）4：5：1混合并置于-20℃保存。
（3）建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(elisa)
优化了封阻溶液、分析物稀释液和抗原抗体反应ph这三种实验条件，在最佳条件的基础上，绘制出标准曲线（见图2）。结果表明，该单克隆抗体对茉莉酸甲酯（meja）的特异性以及灵敏度（ic50）优于对茉莉酸（ja）。在此发现上建立了以单克隆抗体为基础以茉莉酸甲酯（meja）为实际检测对象的酶联免疫吸附分析方法(elisa)。该方法对茉莉酸甲酯（meja）的ic50和lod分别为2.02ng/ml和0.20ng/ml。
其中溶液配制如下
(a).碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液
称取2.606gna2co3•10h2o，3.434gnahco3，用800ml超纯水混匀溶解后，调节ph值，加水至1l，配成0.05mol/l，ph=9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；
(b).磷酸缓冲液(储备液，pbsx10)
称取21.961gna2hpo4•12h2o，6.031gnah2po4•2h2o，87.666gnacl，加800ml超纯水混合，加热溶解；用1mol/l的naoh调节ph=7.4；加超纯水至1l，配成含0.15mol/lnacl，ph=7.4的0.1mol/l磷酸缓冲液(储备液)；
(c).封阻溶液
称取酪蛋白加热溶解于0.01mol/l的pbs中，配成0.5~2%酪蛋白溶液；
(d).磷酸缓冲液-吐温储备液（含1%tween20的0.1mol/l磷酸缓冲储备液，pbstx10,ph=7.4）。
(e).底物溶液（20ml纯水；1ml醋酸钠缓冲液；200μl四甲基联苯胺（tmb）（1%）；20μl过氧化氢（5%））
①.醋酸钠缓冲液
称取3.450gch3coona•3h2o，用100ml超纯水溶解，再用1mol/l柠檬酸（称取21.031gc6h8o7•h2o溶解于100ml水中）调节ph=5.8后，再加水到250ml容量瓶中，配成0.1mol/l醋酸钠缓冲液；
②.tmb:称取0.0717gtmb，用7.17ml二甲基亚砜溶解，混匀，配成1%，v/v；
(f).h2so4溶液：移取25ml浓h2so4，溶解于475ml的超纯水中，配成5%h2so4溶液；
（4）交叉反应实验
6种不同的类似物（结构见图3）作为交叉反应物来证明该方法的特异性。包括3种结构类似物（茉莉酸ja；二氢茉莉酸甲酯dhmeja;葫芦酸ca）、2种功能类似物（脱落酸aba；水杨酸sa）和1种生物合成前体（亚麻酸la）。交叉反应率计算公式如下：
交叉反应结果见表1，由表可知，该抗体对茉莉酸甲酯的特异性高于对茉莉酸，因此本实验的将茉莉酸转化为茉莉酸甲酯的方法是可行的。虽然它对二氢茉莉酸甲酯具有很高的特异性，但是该物质多为人工合成，植物体内发现的很少，因此可不考虑二氢茉莉酸对结果的影响。此外，该抗体对其他物质几乎没有响应。
（5）elisa对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定
①样品提取方法
本文根据检测目标物的不同设计了两种不同的样品提取方法，分别用于检测植物样品中的茉莉酸含量（ja）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（jas），但是最终都是以茉莉酸甲酯（meja）的形式作为被检测对象。
检测植物中茉莉酸含量（ja）的提取方法：参考ny/t2871-2015方法并稍作修改。新鲜植物材料(0.5g)剪碎后于2ml预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时。（然后加入一定的ja标准溶液，形成一系列加标样品。）离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时。再次离心取上清，合并上清液，用甲酸调节ph至2.5-3.0，后上sep-pakc18小柱(waters,milford,usa)。上柱前用2ml20%甲醇水溶液（甲醇-水：20-80，v/v）活化平衡小柱。上样后按以下步骤：①用2ml1%甲酸水溶液（1ml甲酸加水至100ml）淋洗；②用2ml甲醇淋洗；③用2ml0.5%氨水甲醇（0.5mlnh4oh加甲醇至100ml）洗脱两次，收集洗脱液。洗脱液中加入重氮甲烷将提取物茉莉酸（ja）甲基化10分钟获得茉莉酸甲酯（meja）。然后将其均分成两部分，分别用于elisa和hplc分析。室温下氮气吹干。其中一份复溶于0.2ml甲醇，再用pbs稀释，用于elisa；另一份用1ml甲醇复溶，直接用于hplc分析。加标实验中的标准溶液最终浓度为：0,5,10,15,20,25和30µgml-1（单位转换后为0，23.78，47.56，71.34，95.12，118.9和142.7nmolg-1）。
检测植物中茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（jas）的提取方法：新鲜植物材料(0.5g)剪碎后于2ml预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时。离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时。再次离心取上清，合并上清液。提取液中加入重氮甲烷将提取物中的茉莉酸（ja）甲基化10分钟使得其中茉莉酸和茉莉酸甲酯均以茉莉酸甲酯（meja）的形式存在。然后将其均分成两部分，分别用于elisa和hplc分析。室温下氮气吹干。其中一份复溶于0.2ml甲醇，再用pbs稀释，用于elisa；另一份用1ml甲醇复溶，直接用于hplc分析。
hplc测定条件为：色谱条件:c18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈：0.2%三乙胺水溶液（用磷酸调节ph至4）=60:40（v/v）；流速为0.8ml/min；进样量为10μl；紫外检测波长为210nm；柱箱温度为35℃；在10分钟左右出峰。
②实际样品的检测并与hplc比较
选择了三种样品：一串红（salviasplenden）叶子、一串红（salviasplenden）花朵和葡萄果实进行样品实验。根据两种样品提取方法，分别对植物中茉莉酸含量（ja）和茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（jas）进行测定。
由于两种提取方法最终都是以茉莉酸甲酯（meja）的形式作为被检测对象，茉莉酸甲酯（meja）分子量为224.30g/mol，茉莉酸（ja）分子量为210.27g/mol，为了方便单位统一，均用nmol/g(fw)来表示茉莉酸（ja）含量、茉莉酸和茉莉酸甲酯（jas）总含量以及通过计算得到的茉莉酸甲酯（meja）含量。
结果见表2，可知，植物中茉莉酸类植物激素主要以茉莉酸为主，茉莉酸甲酯的含量相较而言很少。elisa和hplc较好的相关性、批内批间变异系数均说明此方法对植物样品中ja和jas的检测具有很好的实用性和准确性。
③加标回收实验
为了进一步证明本方法的实用性和准确性，对一串红（salviasplenden）叶子进行了一系列加标实验，检测茉莉酸（ja）的加标回收率。加标实验中的标准溶液最终浓度为：0，23.78，47.56，71.34，95.12，118.9和142.7nmolg-1。但是由于样品本身有本底，基于hplc的结果，本底为11.85nmolg-1，所以加标样品的理论含ja的量为11.85,35.63,59.41,83.19,107.0,130.8和154.6nmolg-1。加标实验的结果见表3，由表3可知，加标回收率均在80-120%可接受的范围内，并与hplc有很好的相关性（相关图见图4），回归曲线为y=1.346x-1.360（r2=0.997，n=7），进一步证明了本方法的实用性和准确性。
表1交叉反应物的ic50以及交叉反应率cr
表2三种样品实验结果
aelisa直接检测出来的结果是以meja为分析对象的单位为µg/g的ja的含量，将结果除以meja的分子量224.3g/mol就得到植物样品中ja的含量（nmol/g）。b变异系数基于n=3。celisa直接检测出来的结果是以meja为分析对象的单位为µg/g的ja和meja（jas）的总含量，将结果除以meja的分子量224.3g/mol就得到植物样品中ja和meja（jas）的总含量（nmol/g）。d用jas的含量减去ja的含量得到植物中meja的含量。
表3加标回收实验结果
a向样品中加入一定量的ja，使得加入的ja最终含量为0,5,10,15,20,25和30µg/g，除以ja的分子量210.27g/mol换算成0,23.78,47.56,71.34,95.12,118.9和142.7nmol/g。b从表2可知，该样品本身含有ja，基于表2中hplc的结果，本底为11.85nmol/g，故加标样品中理论ja含量为本底值加加标值。