本发明涉及探针结合载体的制造方法、探针结合载体和检测或分离目标物质的方法。
背景技术
为了进行例如传染病·癌症标志物、激素等目标物质(检测对象物质)的检测，有机聚合物粒子和磁性粒子等载体已经作为利用了抗原抗体反应的诊断试剂的反应固相等而使用。例如，在这样的诊断试剂中，在载体上固定抗体或抗原等检查用探针(一次探针)。样品中的检测对象物质介由一次探针被捕捉到载体上后，与第二检查探针(二次探针)反应。二次探针只要用荧光物质、酶进行标记等，就能够通过荧光、酶反应等进行检测。
近年来，出于疾病的早期发现等目的，不断要求检查的高灵敏度，诊断试剂的灵敏度提高已经成为一个主要课题。在使用载体的诊断试剂中，为了提高灵敏度，也正在从使用酶显色作为检测法的方式转变为可得到更高灵敏度的使用荧光、化学发光的方式。
作为在这样的用途中的上述载体，例如已知有在表面具有甲苯磺酰基的磁性粒子(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平3-46565号公报
技术实现要素：
对于上述专利文献中记载的磁性粒子等以往的载体，利用该载体的诊断、检测等时的信号/噪声(s/n)比不足，在该方面存在改进的余地。
本发明的一个实施方式提供蛋白质、核酸等生物体相关物质的非特异性吸附少、能够在诊断、检测等时表现出较高的s/n比的探针结合载体和该载体的制造方法。
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现根据下述构成例，能够解决上述课题，从而完成了本发明。
本发明的构成例如下。
＜1＞一种探针结合载体的制造方法，包括：混合具有甲苯磺酰基的载体和探针的工序1、和减少载体表面的甲苯磺酰基量的工序2，
在上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2相对于上述工序1中使用的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a的比例(s2/s1a×100％)为140％以上。
＜2＞根据＜1＞所述的制造方法，其中，上述工序1为在硫酸铵的存在下混合上述载体和探针的工序。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制造方法，其中，在上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2相对于上述工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b的比例(s2/s1b×100％)为110％以上。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的制造方法，其中，上述工序1包含：混合具有甲苯磺酰基的载体和硫酸铵的工序1a、和在该工序1a后混合探针的工序1b。
＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的制造方法，其中，上述载体为磁性粒子。
＜6＞根据＜5＞所述的制造方法，其中，上述磁性粒子具有核壳结构。
＜7＞根据＜5＞或＜6＞所述的制造方法，其中，上述磁性粒子的体积平均粒径为0.1～20μm。
＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项所述的制造方法，其中，上述工序1为在含有硫酸铵的液体中混合载体和探针的工序，载体与探针接触时的液体中的硫酸铵浓度为2.0mol/l以下。
＜9＞根据＜1＞～＜8＞中任一项所述的制造方法，其中，上述工序1为在液体中混合载体和探针的工序，该液体的ph为6～12。
＜10＞根据＜1＞～＜9＞中任一项所述的制造方法，其中，在上述工序1中使用的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a为
＜11＞根据＜1＞～＜10＞中任一项所述的制造方法，其中，上述探针为蛋白质或核酸。
＜12＞根据＜1＞～＜11＞中任一项所述的制造方法，其中，上述工序1中的混合时间为2小时以上。
＜13＞根据＜1＞～＜12＞中任一项所述的制造方法，其中，上述工序2为混合在工序1中得到的载体和封闭剂、或者使载体表面的甲苯磺酰基进行水解反应的工序，该混合时间或反应时间为2小时以上。
＜14＞一种探针结合载体，是在具有甲苯磺酰基的载体上结合有探针的探针结合载体，
该探针结合载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积为
＜15＞根据＜14＞所述的探针结合载体，其中，封闭剂进行共价结合。
＜16＞根据＜14＞或＜15＞所述的探针结合载体，其中，探针结合载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2’相对于探针结合前的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a’的比例(s2’/s1a’×100％)为140％以上。
＜17＞根据＜14＞～＜16＞中任一项所述的探针结合载体，其中，用于体外诊断试剂或生物体相关物质检测。
＜18＞一种检测或分离的目标物质的方法，使用＜14＞～＜16＞中任一项所述的探针结合载体。
根据本发明的一个实施方式，能够容易地得到蛋白质、核酸等生物体相关物质的非特异性吸附少、探针活性较高的探针结合载体，另外，通过在诊断、检测等时，特别是在化学发光免疫测定(clia)、化学发光酶免疫测定(cleia)、生物发光酶免疫测定(bleia)或电化学发光免疫测定(eclia)等免疫测定时使用该载体，能够得到s/n比较高的结果(能够使诊断、检测等高灵敏度化)。
具体实施方式
以下，对本发明的优选的实施方式进行详细说明。应予说明，本发明不仅限定于以下记载的实施方式，应该理解为还包含在不变更本发明的要旨的范围实施的各种变形例。应予说明，在本说明书中，表示数值范围的“a～b”等的记载与“a以上b以下”含义相同，在该数值范围内包含a和b。
另外，在本说明书中，“～(甲基)丙烯酸酯”是指包括“～丙烯酸酯”和“～甲基丙烯酸酯”这两者的概念。同样的记载具有同样的含义。
《探针结合载体的制造方法和探针结合载体》
本发明的一个实施方式的探针结合载体的制造方法(以下也称为“本方法”)包括：混合具有甲苯磺酰基的载体和探针的工序1、以及减少载体表面的甲苯磺酰基量的工序2，
在上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2相对于在上述工序1中使用的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a的比例(s2/s1a×100％)为140％以上。
本发明的一个实施方式的探针结合载体为在具有甲苯磺酰基的载体上结合有探针的载体，该载体的表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2’为
该探针结合载体的制造方法没有特别限制，可以为以往公知的方法，但优选为本方法。
＜工序1＞
上述工序1只要混合具有甲苯磺酰基的载体和探针，就没有特别限制，从能够使载体与探针容易接触而容易地得到所希望的探针结合载体等方面考虑，优选为在液体中混合上述载体和探针的工序。该情况下，可以在上述载体和探针的混合物中添加液体进行混合，也可以在探针的分散液或包含探针的试样中添加上述载体进行混合，优选在上述载体的分散液中添加探针进行混合。
作为上述混合的方法，没有特别限制，在液体中混合上述载体和探针的情况下，可以仅仅进行静置，也可以进行搅拌等。
上述工序1中的混合时间根据所使用的载体和探针的种类、量等进行变化，但从能够容易地得到探针充分结合而成的探针结合载体等方面考虑，优选为2小时以上，更优选为6小时以上，特别优选为8小时以上。另外，从能够高效地制作探针结合载体的等方面考虑，优选为48小时以下，更优选为36小时以下，特别优选为24小时以下。
上述工序1可以在室温下进行，也可以在加热等下进行。
作为该加热时的温度，可以根据所使用的载体和探针的种类等进行适当的选择，从能够保持探针活性并且高效地制作探针结合载体等方面考虑，优选为4～50℃，更优选为20～45℃，特别优选为35～40℃。
另外，上述工序1为在液体中混合载体和探针的工序时，从提高探针与载体的结合量等方面考虑，该液体的ph优选为6～12，更优选为7～11，特别优选为8～10。
上述工序1通常在大气中进行，但可以根据所使用的载体、探针等，在非活性气体环境等特定的气体环境下、手套箱等特定的容器或装置内进行。
上述工序1优选为在硫酸铵存在下混合上述载体和探针的工序。
通过在上述混合载体和探针时的体系中存在硫酸铵，从而探针对上述载体的结合量增加，特别是在使用亲水性高的探针作为探针时，载体与探针的结合量容易降低，但利用因盐析所致的蛋白质等的疏水化，即便在使用这样的探针的情况下，也能够容易地得到探针对上述载体的结合量较多的探针结合载体。
上述工序1优选为包括混合上述载体和硫酸铵的工序1a、以及在该工序1a后混合探针的工序1b的工序。采用这种工序，能够抑制探针暴露在局部高浓度的硫酸铵中，因此探针不易沉淀或凝聚，能够更均匀地与载体结合，因此在使用所得到的载体进行诊断、检测等时能够表现出低噪声、高信号。
另外，由于与上述相同的理由，上述工序1优选为在含有硫酸铵的液体中混合载体和探针的工序。该情况下，载体与探针接触时的液体中的硫酸铵浓度可以根据探针的亲水性进行调整，没有特别限定，优选为2.0mol/l以下，更优选为0.1～2.0mol/l，特别优选为0.2～1.0mol/l。
硫酸铵浓度小于上述下限时，有可能无法在载体中结合足够量的探针，因此，有时导致使用所得到的载体进行诊断、检测等时的信号降低，硫酸铵浓度超过上述上限时，探针容易沉淀或凝聚，有时导致使用所得到的载体进行诊断、检测等时的信号降低。
已知一般使由甲苯磺酰基保护的羟基与探针的氨基等结合时，在探针的亲水性低、容易与载体表面相互作用的情况下，硫酸铵为低浓度或不需要，但在使用亲水性高的探针的情况下与载体的结合效率明显降低。使用亲水性高的探针时，为了提高探针与载体的结合效率，需要降低探针的亲水性，使其容易与载体表面相互作用，但通过硫酸铵浓度在上述范围，从而在直到足够量的探针结合结束为止的时间内探针不易沉淀，因而优选。另外，通过硫酸铵浓度在上述范围，能够抑制探针改性或凝聚，因此能够容易地得到充分结合有探针的、不损害探针所具有特性的(探针活性高的)探针结合载体，通过在诊断、检测等时特别是在clia、cleia等免疫测定时使用该载体，能够得到s/n比较高的结果(能够使诊断、检测等高灵敏度化)。
在液体中进行上述工序1时，作为该液体，没有特别限制，可以根据所使用的载体、探针进行选择，从可以优选用于生物化学用途等、对环境造成不良影响的程度低、对操作作业者的安全性也高等方面考虑，通常使用水系介质。更具体而言，可使用各种缓冲液、水、与水以任意比例混和的醇等有机溶剂和水的混合溶剂等。其中，优选缓冲液。作为缓冲液，优选在ph6～12具有缓冲能力的缓冲液，更优选在ph7～11具有缓冲能力的缓冲液，特别优选在ph8～10具有缓冲能力的缓冲液。另外，作为这样的缓冲液，优选不含有与甲苯磺酰基反应的成分，例如可举出硼酸钠缓冲液。
作为上述水系介质，只要含有水，就没有特别限制，可以含有1种或2种以上的水以外的非水介质。
另外，在上述液体中除上述载体、探针、硫酸铵和水系介质以外，还可以含有以往公知的添加剂，作为这样的添加剂，例如可举出表面活性剂、分散剂、ph调节剂、盐类、高分子聚合物等稳定化剂。
〈具有甲苯磺酰基的载体〉
上述载体只要在其表面具有甲苯磺酰基，就没有特别限制。具有该甲苯磺酰基的载体通常只要与探针混合或接触，就能够使探针在载体的表面进行化学结合，因此优选应用具有甲苯磺酰基的载体。另外，由于载体具有甲苯磺酰基，所以即便不使用缩合剂等，也能够使该载体与探针结合，因此通过使用该载体，能够容易地得到用于简便地进行诊断、检测等的探针结合载体。
在上述工序1中使用的载体可以为2种以上，通常为1种。
应予说明，在本发明中甲苯磺酰基是指对甲苯磺酰基。
上述载体的形状没有特别限定，可以为粒子状、板状、过滤器状、片状等中的任一种，优选粒子状。作为粒子状的载体，可举出由有机聚合物构成的粒子、由无机材料构成的粒子、或包含这两者的粒子。其中，从轻量、能够容易地形成所希望的粒子等方面考虑，优选含有有机聚合物的有机聚合物粒子。
上述有机聚合物粒子可以为交联聚合物，也可以为非交联聚合物，优选至少在表面具有交联聚合物的粒子。利用该交联聚合物的交联结构，能够抑制在液体中进行本方法时的粒子向液体中的溶解、或因该液体所致的粒子表面的溶胀。在有机聚合物粒子中，至少在其表面不具有交联聚合物的情况下，在液体中进行本方法时，粒子表面溶解于该液体，有时已结合的探针脱离而导致灵敏度降低，或者有时因该液体而粒子表面溶胀使生物体相关物质的非特异性吸附增加。
应予说明，本发明中的“至少在粒子表面具有”是指构成粒子表面的成分，有机聚合物粒子不一定必须具有核壳结构。因此，上述有机聚合物粒子整体可以为交联聚合物。
作为上述载体，优选具有磁性体的磁性粒子。通过使用磁性粒子作为上述载体，从而容易将与该载体结合的成分和其以外的成分除去等，因此能够大幅简化诊断、检测、分离等操作。
作为上述磁性粒子，具体而言，可举出以下的(i)～(iv)中的任一种粒子。其中，从可以容易地调整粒径、磁性体含量等方面考虑，优选具有核壳结构的下述(ii)或(iii)的粒子，更优选(iii)的粒子。
(i)在含有有机聚合物的连续相或二氧化硅等无机材料中分散有磁性体粒子的粒子
(ii)以磁性体粒子或磁性体粒子的2次凝聚体为核、以有机聚合物或二氧化硅等无机材料为壳的粒子
(iii)以母粒子为核、以含有有机聚合物的层为壳的粒子，上述母粒子具有由有机聚合物或二氧化硅等无机材料构成的核粒子和设置于该核粒子的表面的含有磁性体粒子的磁性体层(2次凝聚体层)
(iv)可以在粒子的最外层设置含有有机聚合物的层作为壳、在由有机聚合物或无机材料构成的多孔粒子的孔内分散有磁性体粒子的粒子
作为上述有机聚合物，没有特别限定，可以为琼脂糖、葡聚糖、纤维素等天然高分子，也可以为合成高分子。作为上述有机聚合物，可举出来自选自单官能性单体和交联性单体中的1种或2种以上的聚合物。
作为单官能性单体，例如，可举出苯乙烯、α-甲基苯乙烯、卤代苯乙烯等单官能性芳香族乙烯基系单体；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯、(甲基)丙烯酸2-氨基乙酯、1,4-环己烷二甲醇单(甲基)丙烯酸酯等单官能性(甲基)丙烯酸酯系单体；(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚、(甲基)丙烯酸3,4-环氧环己酯、(甲基)丙烯酸甲基缩水甘油酯等含有缩水甘油基的单体；(甲基)丙烯酸2-羟乙酯、2-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸2-羟丙酯、2-羟丙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸2-羟丁酯、2-羟丁基(甲基)丙烯酰胺、甘油单(甲基)丙烯酸酯、甘油单(甲基)丙烯酰胺等含有羟基的单体。
作为交联性单体，例如可举出二乙烯基苯等多官能性芳香族乙烯基系单体；乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇六(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烯丙酯等多官能性(甲基)丙烯酸酯系单体；丁二烯、异戊二烯等共轭二烯烃。
作为上述有机聚合物，从能够容易地向载体表面导入甲苯磺酰基等方面考虑，优选使用选自含有缩水甘油基的单体和含有羟基的单体中的1种或2种以上。
以下，对(iii)的粒子进行说明。
上述核粒子基本上为非磁性物质，可以使用有机物质和无机物质中的任一种，可以根据探针结合载体的使用目的等而适当地选择，从复合化时的加工性、轻量性等方面考虑，优选由有机聚合物构成的粒子。
作为构成上述核粒子的有机聚合物，优选乙烯基系聚合物，更优选为交联聚苯乙烯、交联丙烯酸酯、交联聚甲基丙烯酸甲酯。这些聚合物可以导入羧基等官能团。
这样的核粒子可以利用以往公知的方法、例如日本特公昭57-24369号公报、日本特开昭61-215602号公报、日本特开昭61-215603号公报、日本特开昭61-215604号公报中记载的方法进行制造。
上述核粒子的体积平均粒径(以下，也简称为“粒径”)可以利用实施例中记载的方法进行测定。从磁分离性优异、不易发生重力沉降、能够均匀地形成反应场等方面考虑，粒径优选为0.1～10μm，进一步优选为0.2～5μm，特别优选为0.3～2μm。
作为上述磁性体，例如可举出四氧化三铁(fe3o4)、三氧化二铁(γ-fe2o3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属、或钴、镍、锰等的合金。
其中，优选粒径为50nm以下、优选5～30nm的氧化铁系的超顺磁性微粒，更优选含有afe2o4(a为mn、co、ni、mg、cu、zn或li0.5fe0.5等)表示的铁氧体、磁铁矿(fe3o4)或γ-fe2o3的超顺磁性微粒，从饱和磁化强且剩余磁化少等方面考虑，特别优选由γ-fe2o3和fe3o4构成的超顺磁性微粒。应予说明，磁性体的粒径是在电子显微镜照片中任意选择的100个粒子的粒径的平均值。
上述磁性体粒子优选为表面进行过疏水化处理的粒子。
磁性体粒子表面的疏水化处理方法没有特别限定，例如可举出使在分子内具有与磁性体粒子亲和性高的部分和疏水性的部分的疏水性物质跟磁性体粒子接触而结合的方法。作为该方法，更具体而言，可举出由市售的油性磁性流体得到粒子、使该粒子干燥的方法等。
上述磁性体粒子的使用量可以根据母粒子、磁性体粒子的粒径等而适当地变化，没有特别限制，优选以多个磁性体粒子被覆整个核粒子表面的量使用，更优选以核粒子与磁性体粒子的质量比为10:1～1:3的量使用。
作为在核粒子的表面形成有上述磁性体层的母粒子的制造方法，没有特别限制，例如可举出通过将属于非磁性体的有机聚合物粒子等核粒子和磁性体粒子进行干式混合，从外部施加物理力而使双方粒子复合化的方法。
作为施加物理力的方法，例如可举出研钵、自动研钵、球磨机、叶片加压式粉体压缩法、机械融合法这样的利用机械化学效果的方法、或喷射式粉碎机、hybridizer等利用在高速气流中的冲击的方法。为了高效且牢固地实施复合化，优选物理吸附力强。作为其方法，例如可举出在带搅拌叶片的容器中以搅拌叶片的圆周速度优选15m/秒以上、更优选30m/秒以上、进一步优选40～150m/秒进行搅拌。如果搅拌叶片的圆周速度低于15m/秒，则有时无法使磁性体粒子充分地吸附于核粒子的表面。应予说明，搅拌叶片的圆周速度的上限没有特别限制，可以根据使用的装置、能效等方面来决定。
上述壳例如可以通过在由前述的方法制备的母粒子的存在下，在添加有主原料(选自上述单官能性单体和交联性单体中的1种或2种以上)和根据需要的副原料(聚合引发剂、乳化剂、分散剂、表面活性剂、电解质、交联剂、分子量调节剂等)的液体中进行聚合而形成。
上述有机聚合物粒子、磁性粒子在其表面具有甲苯磺酰基。在表面具有甲苯磺酰基的粒子的制造方法可以是使用具有甲苯磺酰基的单体来制作粒子的方法、或者利用形成壳等时的反应等而生成甲苯磺酰基的方法等，从能够容易地得到所希望的载体等方面考虑，优选通过在制作表面具有羟基的粒子后，在胺等的存在下使对甲苯磺酰氯等含有甲苯磺酰基的化合物与该羟基反应等而导入甲苯磺酰基的方法。
上述表面具有羟基的粒子的制造方法没有特别限制，可以通过以往公知的方法进行，优选例如使用上述含有羟基的单体作为形成上述壳时的有机聚合物的方法，或者使用含有缩水甘油基的单体作为形成上述壳时的有机聚合物并使该缩水甘油基在酸等作用下开环的方法。
作为上述羟基，从能够容易、高效地向载体表面导入甲苯磺酰基等方面考虑，优选2,3-二羟丙基(-ch2ch(oh)ch2(oh))。
导入甲苯磺酰基之前的载体优选亲水性高，与水(25℃)的接触角优选为40°以下，更优选为30°以下，特别优选为10°～25°。
如果接触角在上述范围，则能够容易地得到在诊断、检测等时可表现出较高的s/n比的探针结合载体。如果接触角超过上述范围的上限，则有时生物体相关物质与探针结合载体的非特异性吸附增加。
应予说明，在本发明中，载体为粒子状时，接触角是使用由载体构成的干燥涂膜进行测定而得到的。
该干燥涂膜是通过使用涂敷器将含有50mg载体粒子的0.2ml的水分散液涂布于载玻片等平滑的基材，以湿度40％、气温25℃干燥24小时而得到的涂膜。
该干燥涂膜与水的接触角可以由如下角度求出，即滴加约1μl的水滴(25℃)到干燥涂膜上，立即用照相机拍摄该涂膜的来自水平方向的图像，假定水滴的轮郭为圆周的一部分而与涂膜的水平线的角度。
接触角在上述范围的导入甲苯磺酰基之前的载体可以根据在形成粒子(表面)时使用的单体的量和种类等进行调整。
在导入上述甲苯磺酰基时，只要使粒子表面的羟基的至少1个与含有甲苯磺酰基的化合物反应即可。
因此，向具有2,3-二羟丙基的粒子中导入甲苯磺酰基而得到的粒子可以为具有2-羟基-3-(4’-甲基苯基)磺酰氧基丙基、3-羟基-2-(4’-甲基苯基)磺酰氧基丙基或2,3-二(4’-甲基苯基)磺酰氧基丙基的粒子中的任一种。
应予说明，因为未进行甲苯磺酰化的剩余的羟基有助于载体的亲水化，所以存在有助于诊断、检测等时的低噪声化的趋势。
·粒径
上述载体为粒子时，优选为磁性粒子时，载体的粒径优选为0.1～20μm，更优选为0.2～15μm，特别优选为0.3～10μm。
如果粒径在上述范围，则能够容易地得到每单位体积的探针的结合量较多的载体，通过使用该载体，从而使诊断、检测等时的灵敏度变得良好。粒径低于上述范围的下限时，容易使利用离心分离等的分离花费很长时间，存在水等清洗溶剂与粒子的分离不充分的趋势，因此目标以外的分子(例如，蛋白质、核酸等生物体相关物质)的除去变得不充分，存在无法充分精制的情况。另一方面，如果粒径超过上述范围的上限，则比表面积变小，探针的结合量变少，结果存在灵敏度变低的情况。
对于粒径而言，详细内容进行后述，通过细孔电阻法(库尔特计数法)而求出。
·载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积
上述载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积(工序1中使用的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a和探针结合前的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a’)优选为
如果面积s1a和s1a’在上述范围，则能够容易地得到在诊断、检测等时可表现出较高的s/n比的探针结合载体。
面积s1a和s1a’低于上述范围的下限时，因为载体表面的甲苯磺酰基密度高，所以存在探针容易以多点结合于载体表面的趋势，有时因探针改性而导致信号降低，而且，容易在探针结合载体残留过量的甲苯磺酰基，存在载体表面进一步变为疏水性的趋势，因此有时导致使用该载体的诊断、检测等时的噪声增大。另一方面，面积s1a和s1a’超出上述范围的上限时，存在无法在载体上结合足够量的探针的趋势，因此，有时导致使用该载体的诊断、检测等时的信号降低。
本发明人进行了深入研究，结果发现在载体为含有有机聚合物的粒子的情况下，在有机溶剂中测定甲苯磺酰基量时，因该载体的溶胀而不仅测定存在于载体表面的甲苯磺酰基量，还一并测定存在于内部的甲苯磺酰基量，不适合作为评价载体的表面物性的方法。因此，详细内容进行后述，但通过在水系介质中测定载体表面的甲苯磺酰基量，从而成功地对仅载体表面的甲苯磺酰基进行定量。由此能够对与探针的结合有关的甲苯磺酰基量、可成为非特异性吸附的一个因素的甲苯磺酰基量进行评价。
本发明中的每1个甲苯磺酰基所占的面积的详细内容进行后述，是在水系介质中测定的值。
·接触角
具有甲苯磺酰基的载体表面与水(25℃)的接触角优选为50°以上。该载体为粒子状时，由该载体构成的干燥涂膜与水(25℃)的接触角优选为70°以上，更优选为90°以上，特别优选为105°～120°。
如果接触角在上述范围，则能够容易地得到在诊断、检测等时可表现出较高的s/n比的探针结合载体。如果接触角小于上述范围的下限，则有时使用得到的探针结合载体在诊断、检测等时的灵敏度降低。
另外，通过使用导入甲苯磺酰基前的载体的接触角在上述范围、且导入甲苯磺酰基后的载体的接触角在该范围的载体，能够抑制生物体相关物质与探针结合载体的非特异性吸附，能够使利用探针结合载体的诊断、检测等高灵敏度化。
接触角在上述范围的具有甲苯磺酰基的载体可以根据甲苯磺酰基的导入程度等进行调整。
〈探针〉
作为上述探针，没有特别限制，可以为在诊断、检测等中使用的物质，优选为特异结合性物质，具体而言，优选蛋白质或核酸，更优选为抗原、抗体或亲和素，特别优选为抗原或抗体。
工序1中使用的探针可以为2种以上，但通常为1种。
作为上述抗原或抗体，优选为与一般在被检体中含有的成分反应的抗原或抗体，例如可举出抗纤溶酶检查用抗抗纤溶酶抗体、d二聚体检查用抗d二聚体抗体、fdp检查用抗fdp抗体、tpa检查用抗tpa抗体、tat检查用抗tat复合物抗体、fpa检查用抗fpa抗体等凝血纤溶相关检查用抗原或抗体；bfp检查用抗bfp抗体、cea检查用抗cea抗体、afp检查用抗afp抗体、铁蛋白检查用抗铁蛋白抗体、ca19-9检查用抗ca19-9抗体等肿瘤相关检查用抗原或抗体；载脂蛋白检查用抗载脂蛋白抗体、β2-微球蛋白检查用抗β2-微球蛋白抗体、α1-微球蛋白检查用抗α1-微球蛋白抗体、免疫球蛋白检查用抗免疫球蛋白抗体、crp检查用抗crp抗体等血清蛋白相关检查用抗原或抗体；hcg检查用抗hcg抗体等内分泌功能检查用抗原或抗体；hbs抗原检查用抗hbs抗体、hbs抗体检查用hbs抗原、hcv抗体检查用hcv抗原、hiv-1抗体用hiv-1抗原、hiv-2抗体检查用hiv-2抗原、htlv-1检查用htlv-1抗原、支原体症检查用支原体抗原、弓形虫检查用弓形虫抗原、aso检查用链球菌溶血素o抗原等传染病相关检查用抗原或抗体；抗dna抗体检查用dna抗原、rf检查用热变性人igg等自身免疫相关检查用抗原或抗体；地高辛检查用抗地高辛抗体、利多卡因检查用抗利多卡因抗体等药物分析用抗原或抗体。
作为上述抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一者。
作为上述亲水性高的探针，例如可举出在探针1质量％和硫酸铵33质量％的水溶液或缓冲溶液中也不产生盐析所致的沉淀的探针。
从能够使利用得到的探针结合载体的诊断、检测等高灵敏度化等方面考虑，上述工序1中使用的探针的使用量优选使用在工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b相对于上述工序1中使用的(结合探针前的)载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a的比例(s1b/s1a×100％)为下述范围的量。
另外，在使用磁性粒子作为载体的方式中，从能够使利用得到的探针结合载体的诊断、检测等高灵敏度化等方面考虑，上述工序1中使用的探针的使用量相对于磁性粒子100质量份，优选为0.5质量份以上，更优选为1质量份以上。另外，上限优选为200质量份以下，更优选为100质量份以下。
·工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b
上述工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b优选为
如果面积s1b在上述范围，则能够容易地得到在诊断、检测等时可表现出较高的s/n比的探针结合载体。
在工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b相对于上述工序1中使用的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a的比例(s1b/s1a×100％)优选为110％以上，更优选为120％以上，特别优选为130％以上。
如果面积的比例在上述范围，则能够容易地得到在诊断、检测等时可表现出较高的s/n比的探针结合载体。
＜工序2＞
上述工序2只要是使载体表面的甲苯磺酰基量减少的工序，就没有特别限制，优选为使载体表面的甲苯磺酰基游离的工序。该工序2通常在上述工序1之后进行。
在工序1之后残留的甲苯磺酰基因为疏水性高，所以存在成为生物体相关物质的非特异性吸附的重要因素的趋势，如果在诊断、检测等时使用残留有甲苯磺酰基的载体，则存在导致噪声增大的趋势，因此优选使工序1中得到的载体表面的甲苯磺酰基量减少，特别优选在化学上使甲苯磺酰基游离。
对于上述工序2，具体而言，可举出利用酸或碱使甲苯磺酰基水解而游离的方法、使封闭剂与甲苯磺酰基反应并使甲苯磺酰基游离的方法。上述工序2可以进行这些方法中的任一种，也可以进行2种以上的方法。
作为上述工序2，从能够进一步抑制所得到的探针结合载体的非特异性吸附性等方面考虑，优选使封闭剂与甲苯磺酰基反应的方法。
在使上述封闭剂与甲苯磺酰基反应时，只要将载体和封闭剂混合，就没有特别限制，从能够使载体与封闭剂容易接触而容易地得到所希望的探针结合载体等方面考虑，优选为在液体中混合载体和封闭剂的方法。该方法中的液体可举出与在上述工序1中举出的液体相同的液体，在液体中进行工序1时，可以将工序1中得到的液体直接在工序2中使用。
作为上述混合的方法，没有特别限制，在液体中混合上述载体和封闭剂时，可以仅进行静置，也可以进行搅拌等。
上述混合时的混合时间(载体与封闭剂的反应时间)、水解反应时的反应时间根据使用的载体和封闭剂的种类、量等进行变化，从能够充分进行封闭、容易地得到面积s2在下述范围的探针结合载体等方面考虑，优选为2小时以上，更优选为6小时以上，特别优选为8小时以上。另外，从能够高效地制作探针结合载体等方面考虑，优选为48小时以下，更优选为36小时以下，特别优选为24小时以下。
上述工序2可以在室温下进行，也可以在加热等下进行。
作为该加热时的温度，可以根据使用的载体、封闭剂等的种类等进行适当的选择，从能够高效地制作规定的探针结合载体等方面考虑，优选为4～50℃，更优选为20～45℃，特别优选为35～40℃。
上述工序2通常在大气中进行，也可以根据使用的载体、封闭剂等，在非活性气体环境等特定的气体环境下、手套箱等特定的容器或装置内进行。
〈封闭剂〉
作为上述封闭剂，只要是具有对甲苯磺酰基为反应性的官能团的物质，就没有特别限制，优选为具有能够抑制被检体中的蛋白质、脂质、核酸等生物体分子、细胞、测定试剂中的蛋白质、发光底物、吸光物质等非特异性吸附于载体表面的亲水性官能团的物质。
作为对上述甲苯磺酰基为反应性的官能团，可举出氨基、巯基等亲核性基团。
作为上述亲水性官能团，可举出羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、含有糖的基团、含有两性离子的基团、含有聚乙二醇的基团等。
从能够进一步抑制向探针结合载体的非特异性吸附等方面考虑，上述封闭剂优选为水溶性。这里水溶性是指与水以任意的比例混和，或者在25℃的水1g中溶解10mg以上的性质。
作为上述封闭剂，可以为低分子化合物、肽或蛋白质等生物体高分子、合成高分子中的任一种，在因空间位阻所致的非特异性吸附抑制效果高的方面上，优选生物体高分子或合成高分子，在不将来源于生物体的物质带入到测量系统中等方面上，更优选合成高分子。
作为以封闭剂发挥功能的低分子化合物，可举出三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺等，从特别能够抑制非特异性吸附等方面考虑，优选三羟甲基氨基甲烷。
作为以封闭剂发挥功能的生物体高分子，可举出bsa(牛血清白蛋白)、酪蛋白、明胶，从能够特别抑制非特异性吸附等方面考虑，优选bsa。
作为以封闭剂发挥功能的合成聚合物，公知有在侧链具有聚氧乙烯等亲水聚合物的乙烯基单体的共聚物、聚氧乙烯等亲水性聚合物与其它聚合物的嵌段共聚物、在末端具有官能团的聚氧乙烯等亲水性聚合物等。特别是，日本特开2008-170417号公报中示出的在聚氧乙烯的单末端具有多胺的结构的合成聚合物不仅抑制向载体表面的非特异性吸附，还表现出使抗体等探针的取向有序而提高反应性的效果，因此可以适用于本发明。作为这样的封闭剂，可举出jsrlifesciences(株)制blockmasterce510、ce210。
从能够使利用得到的载体的诊断、检测等高灵敏度化等方面考虑，使用上述封闭剂时的该封闭剂的使用量优选使用在上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2相对于上述工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b的比例(s2/s1b×100％)为下述范围的量。
另外，在使用磁性粒子作为载体的方式中，从能够使利用得到的探针结合载体的诊断、检测等高灵敏度化等方面考虑，上述工序2中使用的封闭剂的使用量相对于磁性粒子100质量份，优选为1质量份以上，更优选为2质量份以上。另外，上限优选为200质量份以下，更优选为100质量份以下。
·探针结合载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积
探针结合载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积(上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2和探针结合载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2’)优选为
本发明人进行深入研究，结果发现如果为具有这样的面积的探针结合载体，则非特异性吸附少，探针活性高。
另外，在减少非特异性吸附、提高探针活性等方面看，面积s2和s2’优选为
残留的甲苯磺酰基存在成为生物体相关物质等的非特异性吸附的重要因素的趋势，如果在诊断、检测等时使用残留有甲苯磺酰基的载体，则存在导致噪声增大的趋势，因此甲苯磺酰基也可以不存在于探针结合载体表面。
在上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2相对于上述工序1中使用的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a的比例(s2/s1a×100％)，以及探针结合载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2’相对于探针结合前的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1a’的比例(s2’/s1a’×100％)优选为140％以上，更优选为150～250％，进一步优选为160～220％，特别优选为170～190％。
面积的比例在上述范围的探针结合载体充分抑制蛋白质、核酸等生物体相关物质的非特异性吸附，尽可能减少甲苯磺酰基，通过使用该载体，能够在诊断、检测时特别是在clia、cleia等免疫测定中实现优异的低噪声、较高的s/n比。
面积的比例小于上述范围的下限时，存在生物体相关物质的非特异性吸附增大的趋势，面积的比例超过上述范围的上限时，存在得不到结合有足够量的探针而成的探针结合载体的趋势，有时在使用该载体的诊断、检测等中得不到较高的信号。
另外，在上述工序2中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s2相对于上述工序1中得到的载体表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积s1b的比例(s2/s1b×100％)优选为110％以上，更优选为115～160％，进一步优选为120～150％，特别优选为125～140％。
面积的比例在上述范围的探针结合载体充分抑制蛋白质、核酸等生物体相关物质等的非特异性吸附，尽可能减少甲苯磺酰基，通过使用该载体，能够在诊断、检测时特别是在clia、cleia等免疫测定中实现优异的低噪声、较高的s/n比。
面积的比例小于上述范围的下限时，存在生物体相关物质的非特异性吸附增大的趋势，面积的比例超过上述范围的上限时，存在得不到结合有足够量的探针而成的探针结合载体的趋势，有时在使用该载体的诊断、检测等中得不到较高的信号。
＜用途＞
上述本法中得到的探针结合载体和本发明的一个实施方式的探针结合载体能够适用于目标物质的诊断、检测，特别是clia、cleia等免疫测定，能够适用于体外诊断试剂用或生物体相关物质检测用。因此，上述探针结合载体也可以称为包含该探针结合载体的体外诊断试剂或生物体相关物质检测剂。具体而言，可以作为生物化学领域中的化合物载体用粒子和诊断试剂用的化学结合载体用粒子等亲和载体使用，优选用于免疫诊断、核酸检测，特别能够作为结合有抗原或抗体等探针的免疫检查用的探针结合粒子使用。
作为上述目标物质，没有特别限制，优选为与上述探针特异性结合的物质，具体而言，可举出免疫检查用试剂和被检查试样等所含的生物体相关物质和化学物质等。
上述生物体相关物质是指与生物体有关的所有物质，例如可举出生物体中含有的物质、由生物体中含有的物质衍生出的物质、可在生物体内利用的物质。作为上述生物体相关物质，没有特别限定，例如可举出蛋白质(例:酶、抗体、适体、受体)、肽(例:谷胱甘肽)、核酸(例:dna、rna)、糖、脂质、和其它细胞或物质(例:包含血小板、红细胞、白细胞等各种血细胞的各种来源于血液的物质、各种游离细胞)。
《检测或分离目标物质的方法》
本发明的一个实施方式的检测或分离目标物质的方法(以下也称为“本检测方法”)使用上述探针结合载体。
本检测方法中，因为使用上述探针结合载体，所以能够以特别优异的高灵敏度检测被检测物质。
作为检测方法的一个例子，使上述探针结合载体与被检体中的目标物质接触，从而介由探针结合载体中含有的探针将目标物质捕捉到该载体上后，使其与二次探针反应。此时，作为二次探针，使用用荧光物质、放射性同位素、酶等标记了的探针，根据需要进一步使用发光试剂等，由此能够利用荧光或酶反应等进行目标物质的检测。
作为分离方法的一个例子，可举出通过在使上述探针结合载体与目标物质反应后，进行集磁、清洗而分离除去目标物质以外的物质的方法。
[实施例]
以下，举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限定于这些实施例。
[粒径的测定]
各磁性粒子的粒径利用multisizer4e(beckmancoulter公司制)进行测定。将分散于0.1质量％tween20水溶液中的1质量％的磁性粒子投入到电解液(beckmancoulter公司制isotonii)100ml中直到浓度传感器显示4～10％的值为止，测定粒子50000个的粒子的粒径，算出其平均值，由此测定体积平均粒径。
[甲苯磺酰基的定量]
将分散于水1ml中的磁性粒子(合成例1中得到的磁性粒子或各工序后的磁性粒子)100mg采取到微管中，加入乙二胺100μl，在40℃下反应15小时。反应后，将微管立在磁性支架中回收上清液。将上清液20μl用离子色谱仪(装置:dionex公司制ics2000，柱:as18，检测:电导率，流速:1.0ml/分钟，测定时间:30分钟，洗脱液:50mm氢氧化钾水溶液)进行分析，求出在保留时间23分钟左右出现的峰的面积。另外，基于利用离子色谱仪对对甲苯磺酸钠进行分析而得到的校正曲线，算出磁性粒子每100mg的表面甲苯磺酰基量。
[磁性粒子表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积的计算]
磁性粒子表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积由下式求出。
磁性粒子表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积＝磁性粒子的表面积/表面甲苯磺酰基的个数
具体而言，由下式求出。
磁性粒子表面的每1个甲苯磺酰基所占的面积[
实施例中使用的磁性粒子的比重由以下的方法求出。
将磁性粒子粉末30mg装入到差热-热重同步测定装置((株)日立高新技术制sta7300)中，以升温温度:10℃/分钟、极限温度:500℃、保持时间:20分钟、取样时间:1.0秒、气体种类:氮、气体流量:200ml/分钟的条件进行测定，分别求出磁性粒子中含有的氧化铁和树脂的质量％。氧化铁比重为5.2[g/cm3]，树脂比重为1.1[g/cm3]，由上述得到的各自的质量％的值算出磁性粒子的比重。
[抗体结合量的定量]
使用bca蛋白质分析试剂盒(bcaproteinassaykit，thermofisherscientific公司制)，进行与磁性粒子结合的抗体的定量。
首先，将溶解了抗体0μg、5μg、10μg或15μg的mes缓冲液(0.1mol/l)50μl分别注入到微管中，将上述试剂盒中的试剂a和试剂b以50/1(v/v)进行混合而制作工作试剂(workingreagent)，向各微管中添加工作试剂1ml。在37℃培养30分钟后，将微管立在磁性支架中回收上清液，进行od562的测定，制作校正曲线。
接下来，将分散于mes缓冲液(0.1mol/l)50μl中的抗psa抗体结合磁性粒子1mg采取到微管中。向其中添加工作试剂1ml，在37℃培养30分钟后，将微管立在磁性支架中回收上清液，进行od562的测定。基于校正曲线算出抗体结合量。
[化学发光酶免疫测定(cleia)]
向白色96孔板的孔1和孔2中分别添加分散于tbs-t缓冲液(137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾，25mmol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(以下，也称为“tris-hcl”)，0.1质量％tween20，ph7.4)50μl的抗psa抗体结合磁性粒子15μg。
接下来，作为噪声测定用，将bsa/tbs缓冲液(1质量％bsa，137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾，25mmol/ltris-hcl，ph7.4)10μl添加于孔1，另外，作为信号测定用，将溶解于bsa/tbs缓冲液(包含1质量％的bsa)10μl的psa抗原10μg添加于孔2，在37℃下反应10分钟。其后，利用磁铁对抗体结合粒子进行集磁，除去上清液，用tbs-t缓冲液清洗粒子。对该集磁-清洗操作进行5次。其后，添加标记有碱性磷酸酶的抗psa抗体50μl，在37℃下反应10分钟。反应后，与上述同样地使用tbs-t缓冲液进行5次的集磁-清洗操作，添加发光底物(fujirebio(株)制classiii系列lumipulse底物液)50μl。从添加发光底物开始5分钟后使用发光计测定噪声和信号的发光强度。
[合成例1]
向油性磁性流体(“exp系列，emg”，(株)ferrotec制)中加入丙酮使粒子析出沉淀后，对其进行干燥，由此得到具有经疏水化处理的表面的铁氧体系(氧化铁)的磁性体粒子(平均一次粒径:0.01μm)。
接下来，利用混合机对聚苯乙烯粒子(体积平均粒径:1.5μm)30g和经上述疏水化处理的磁性体粒子15g进行充分混合，利用hybridizationsystemnhs-0型((株)奈良机械制作所制)对其混合物以叶片(搅拌叶片)的圆周速度100m/秒(16200rpm)处理5分钟，得到在表面具有由磁性体粒子构成的磁性体层的母粒子(粒径:2.0μm)。
接下来，将含有十二烷基硫酸钠0.50质量％的水溶液375g投入到1l可分离式烧瓶中，接着，投入具有上述磁性体层的母粒子15g，利用均化器进行分散后，加热到60℃。
向含有十二烷基硫酸钠0.50质量％的水溶液150g中加入甲基丙烯酸甲酯(以下称为“mma”)27g、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(以下称为“tmp”)3g和过氧化二(3,5,5-三甲基己酰基)(日油(株)制peroyl355(以下称为“peroyl355”))0.6g使其分散而得到预乳液，将该预乳液用2小时滴加到控制为60℃的上述1l可分离式烧瓶中。滴加结束后，保持于60℃，搅拌1小时，然后向含有十二烷基硫酸钠0.50质量％的水溶液75g中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(以下称为“gma”)13.5g、tmp1.5g和peroyl3550.3g使其分散而得到预乳液，将该预乳液用1小时30分钟滴加到控制为60℃的上述1l可分离式烧瓶中。其后升温到75℃，之后进一步继续聚合2小时，结束反应。
继而，向该1l可分离式烧瓶中装入1mol/l硫酸60ml，在60℃下搅拌6小时。接着，利用磁性将上述可分离式烧瓶中的粒子分离后，使用蒸馏水进行反复清洗。由此，得到含有羟基的磁性粒子(a)。
接下来，对磁性粒子(a)进行冻结干燥，使干燥后的磁性粒子(a)1.0g分散于8ml的吡啶后，加入对甲苯磺酰氯0.2g在室温下搅拌2小时。反应后，利用磁性分离粒子，用丙酮清洗4次，接着用蒸馏水清洗4次，得到含有甲苯磺酰基的磁性粒子(b)。粒径为3.0μm。
[实施例1]
使合成例1中得到的磁性粒子(b)10mg分散于溶解有硫酸铵的硼酸缓冲液(硫酸铵:0.5mol/l，硼酸:0.1mol/l，ph9.5)1.5ml。向磁性粒子分散液中加入针对前列腺特异抗原(psa)的抗体(以下称为“抗psa抗体”)100μg在37℃下反应8小时。接着，加入作为封闭剂的ce510(2.0质量％，jsr(株)制)50μl在37℃下反应15小时。反应后，使用磁性支架对粒子进行磁分离，用清洗液(25mmol/ltris-hcl，ph7.4，含有0.01质量％tween20)反复清洗，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-1)。
[实施例2]
使封闭的反应时间为6小时，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-2)。
[实施例3]
使用作为封闭剂的bsa，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-3)。
[实施例4]
使合成例1中得到的磁性粒子(b)10mg分散于硼酸缓冲液(0.1mol/l，ph9.5)1.0ml中，加入抗psa抗体100μg。接着，加入溶解有硫酸铵的硼酸缓冲液(硫酸铵:1.5mol/l，硼酸:0.1mol/l，ph9.5)0.5ml，在37℃下反应8小时。接着加入作为封闭剂的ce510(2.0质量％，jsr(株)制)50μl在37℃下反应15小时。反应后，使用磁性支架对粒子进行磁分离，用清洗液(25mmol/ltris-hcl，ph7.4，含有0.01质量％tween20)反复清洗后，用该清洗液进行稀释使粒子浓度为0.03质量％，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-4)。
[实施例5]
使溶解有硫酸铵的硼酸缓冲液中的硫酸铵浓度为1.0mol/l，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-5)。
[实施例6]
作为粒子，使用dynabeadsm-280tosylactivated(thermofisherscientific公司制)，除此以外，进行与实施例2相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-6)。
[实施例7]
使溶解有硫酸铵的硼酸缓冲液中的硫酸铵浓度为3.0mol/l，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(c-7)分散液。
[比较例1]
作为磁性粒子使用磁性粒子(a)来代替磁性粒子(b)，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(d-1)。
[比较例2]
不进行封闭，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(d-2)。
[比较例3]
使封闭的反应时间为1小时，除此以外，进行与实施例1相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(d-3)。
[比较例4]
不进行封闭，除此以外，进行与实施例6相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(d-4)。
[比较例5]
使封闭的反应时间为1小时，除此以外，进行与实施例6相同的操作，得到抗psa抗体结合磁性粒子(d-5)。
[表1]