本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，还涉及所述谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的制备方法和应用。
背景技术
谷胱甘肽还原酶(gr)是一种黄素酶，每分子酶蛋白含有一分子的fad。由辅酶nadph供氢，催化氧化型谷胱甘肽(gssg)，还原成还原型谷胱甘肽(gsh)。还原型谷胱甘肽(gsh)可使含巯基(-sh)的酶处于还原状态及活性状态，维持红细胞膜的完整性，防止血红蛋白氧化。gr在机体内活性强弱，依次为肝、肾、胰、心、甲状腺、红细胞和血浆。gr定位于微粒体及细胞液部分。因各脏器的组织细胞普遍含有gr，因而gr在机体氧化还原反应中起了举足轻重的地位。
在正常机体代谢过程中，机体存在有效的抗氧化防御系统，不断产生的氧自由基在抗氧化系统的作用下不断地被清除，从而维持生理水平的浓度。抗氧化系统包括细胞内抗氧化酶系统和非酶性的抗氧化剂，其中最主要的是谷胱甘肽抗氧化物酶系统。谷胱甘肽抗氧化物酶系统主要包括谷胱甘肽(gsh)，谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)，谷胱甘肽还原酶(gr)，谷胱甘肽巯基转移酶(gst)。谷胱甘肽是人类细胞中自然合成的，主要在肝内合成，由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的小分子三肽化合物，是细胞内主要的非蛋白质巯基化合物。在细胞内正常环境下以硫醇还原性(gsh)存在，还原型是其主要的活性状态，大约占95％；氧化型谷胱甘肽(gssg)是非活性状态，约占1％。内源性gsh主要存在于胞浆内，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。gsh含有的巯基是其发挥主要作用的基团。在许多生命活动包括基因表达调控、酶活性和代谢调节、对细胞的保护、氨基酸转运、免疫功能调节等起着直接或间接的作用。氧化应激或亲电化合物攻击可使细胞内gsh含量下降，或使其转变为双硫氧化性(gssg)。gr是一种黄素蛋白氧化还原酶，以还原性辅酶ⅱ为供氢体，能催化gssg还原成gsh，对于维持生物体gsh和gssg比的稳定、保持体内氧自由基平衡起着重要作用。gpx可以特异的催化gsh对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，而且能够使脂质过氧化物变成无毒的羟化物。gst在gpx活力低下的条件下，具有清除体内氧自由基的功能，同时能使有害的亲电物质与gsh结合，将其排出体外，从而起到保护体内蛋白质和核酸等的功能。
目前国内测定谷胱甘肽还原酶的方法主要有elisa法和紫外酶法，前者需要手工操作，耗时较长，步骤比较繁琐，价格不菲。目前国内主要推广的方法是紫外酶法，但现有的紫外酶法谷胱甘肽还原酶的试剂盒主要为进口干粉试剂，虽然结果准确，但是价格不菲，使用前需要复溶，操作不方便。复溶后需要尽快使用，使用非常不方便并且复溶后使用不完会出现大量的浪费。而临床生化分析仪上最方便使用的国产液体双试剂目前存在稳定性差，抗干扰能力差等缺点。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，抗干扰能力强的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂r1和试剂r2；
试剂r1中含有以下成分：tris缓冲液50-200mmol/l、edta0.5-2mmol/l、丙酮酸羧化酶1-5ku/l、抗坏血酸氧化酶1-5ku/l、亚铁氰化钾5-20mg/l、表面活性剂1-5ml/l、防腐剂0.5-2g/l；
试剂r2中含有以下成分：tris缓冲液50-200mmol/l、edta0.5-2mmol/l、gssg2-10mmol/l、nadph0.1-0.5mmol/l、稳定剂1-15g/l、防腐剂0.5-2g/l。
优选地，试剂r1的ph值为6.5-7.5；试剂r2的ph值为9.0-10.0。
优选地，试剂r1中所述的表面活性剂为吐温20、tritonx-100、tritonx-405、十二烷基硫酸钠和brij35中的一种或多种。
优选地，试剂r2中所述的稳定剂为可溶性淀粉、海藻糖、甘油的混合物，可溶性淀粉、海藻糖、甘油的质量比2：1-3:6-10。
优选地，试剂r1中所述的防腐剂为叠氮钠、pc300、mit和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
优选地，试剂r2中所述的防腐剂为叠氮钠、pc300、mit和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为1～5:1。
更优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为4:1。
上述所述的谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)试剂r1的配制：取适量水，分别依次加入r1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到ph值6.5-7.5，定容到所需体积；
(2)试剂r2的配制：取适量水，分别依次加入r1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到ph值9-10，定容到所需体积。
上述所述的谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中谷胱甘肽还原酶的浓度。
本发明谷胱甘肽还原酶测定试剂盒原理为谷胱甘肽还原酶(gr)催化氧化型谷胱甘肽(gssg)还原成还原型谷胱甘肽(gsh)，同时还原型辅酶ⅱ(nadph)被氧化成为辅酶ⅱ(nadp+)。nadph在波长340nm有特异吸收峰，其氧化的速率与血清中gr的活性成正比，在340nm处测定nadph吸光度下降的速率，即可计算出gr活性。
反应原理的反应式如下:
本发明的有益效果：
1.本发明稳定的谷胱甘肽还原酶测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。
2.本发明通过试剂r1中添加丙酮酸羧化酶、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾，可以将血清中的干扰物质(如丙酮酸、抗坏血酸、胆红素)去除，提高测定的准确度。
3.本发明通过试剂r2中添加可溶性淀粉、海藻糖、甘油的混合物，可以保护试剂r2中的谷胱甘肽，从而保证试剂室温开瓶避光保存稳定30天，2-8℃闭瓶保存稳定12个月，完全满足临床检验的需要。
附图说明
图1为本发明实施例1谷胱甘肽还原酶测定试剂盒与对比例4、5、6试剂盒的热稳定性变化。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明试剂盒测定血清中谷胱甘肽还原酶的测试条件为：方法：速率法；主/副波长：340nm/405nm；温度：37℃；校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方向：向下。
具体操作如表1所示。
表1谷胱甘肽还原酶测定试剂操作步骤
计算结果：
样本要求：
1.不溶血血清。
2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。
实施例1
试剂r1的组分为：tris缓冲液100mmol/l、edta0.5mmol/l、丙酮酸羧化酶1.5ku/l、抗坏血酸氧化酶2ku/l、亚铁氰化钾6mg/l、吐温201ml/l、叠氮钠0.5g/l；
试剂r2中的组分为：tris缓冲液100mmol/l、edta0.5mmol/l、gssg2mmol/l、nadph0.2mmol/l、可溶性淀粉1g/l、海藻糖1g/l、甘油4g/l、叠氮钠0.5g/l。
试剂r1的ph值为7.0；试剂r2的ph值为9.5；
制备方法:(1)试剂r1的配制：取适量水，分别加入r1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需ph值，定容到所需体积。(2)试剂r2的配制：取适量水，分别加入r1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需ph值，定容到所需体积。
实施例2
试剂r1的组分为：tris缓冲液80mmol/l、edta0.8mmol/l、丙酮酸羧化酶1.2ku/l、抗坏血酸氧化酶2.5ku/l、亚铁氰化钾8mg/l、brij351ml/l、叠氮钠0.5g/l；
试剂r2中的组分为：tris缓冲液80mmol/l、edta0.8mmol/l、gssg2mmol/l、nadph0.2mmol/l、可溶性淀粉1.5g/l、海藻糖1.5g/l、甘油6g/l、叠氮钠0.5g/l。
试剂r1的ph值为6.5；试剂r2的ph值为9.3；
实施例2试剂盒的制备方法同实施例1
实施例3
试剂r1的组分为：tris缓冲液150mmol/l、edta1mmol/l、丙酮酸羧化酶2ku/l、抗坏血酸氧化酶3ku/l、亚铁氰化钾10mg/l、tritonx-1001ml/l、叠氮钠0.5g/l；
试剂r2中的组分为：tris缓冲液150mmol/l、edta1mmol/l、gssg2mmol/l、nadph0.2mmol/l、可溶性淀粉2g/l、海藻糖2g/l、甘油9g/l、叠氮钠0.5g/l。
试剂r1的ph值为7.0；试剂r2的ph值为9.0；
实施例3试剂盒的制备方法同实施例1
对比实施例1
市售的进口谷胱甘肽还原酶测定试剂盒。
对比实施例2
与实施例1中谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r1中不含丙酮酸羧化酶，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例3
与实施例1中谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r1中不含抗坏血酸氧化酶，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例4
与实施例1中谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r1中不含亚铁氰化钾，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例5
与实施例1中谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2中不含可溶性淀粉，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例6
与实施例1中谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2中不含海藻糖，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例7
与实施例1中谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2中不含甘油，其他与实施例1相同，此处不再累述。
性能检测
1、准确性
取40份在检测浓度范围内不同浓度的人源血清样品，以对实施例1作为比对试剂，分别测定40个样本，每个样本测定一次。对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对实施例1检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。见表2、表3。
表2实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4分别与对比实施例1的相对偏差
表3实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4分别与对比实施例1的相关系数
结论：从表2和表3中可知：实施例1和对比例1的相对偏差最大值为2.97％，相关系数r为0.9979，说明实施例1的试剂抗干扰能力强，对于不同浓度样本检测结果都比较准确。而对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4和对比例1的相对偏差有些超过±20％，相关系数都小于0.990，主要原因是血清样本中存在干扰物质，不同样本中含量不同，影响了检测结果的准确性。本发明制得的试剂中添加了丙酮酸羧化酶、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾，该可将血清样本中的干扰物质最大程度去除，提高了临床检验的准确度，保证了检测结果的可靠性。
2、稳定性检测：
将本发明实施例(此处以实施例1为例，也可以为本发明的其他实施例)和对比例5、6、7中的试剂一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为60.5±6u/l的质控品，监测质控品的变化。见表4
表4实施例1和对比实施例5、实施例6、实施例7的质控品浓度变化。
结论：从表4和图1可知，实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例5、6、7试剂盒的稳定性，说明本发明同时加入可溶性淀粉、海藻糖、甘油，对试剂稳定性起到的很好的协同作用，可以显著提高谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的稳定性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。