本发明涉及血液样本中25-羟基维生素d的检测方法。
背景技术：
维生素d是一类脂溶性维生素，属于固醇类衍生物。维生素d主要功能是调节体内钙、磷代谢和维持血浆钙、磷水平的温度，并参与骨骼发育。维生素d家族主要包括维生素d1～d5，其中最重要的是维生素d2(麦角钙化醇)和维生素d3(胆钙化醇)。
25-羟基维生素d是维生素d在肝脏中经干细胞微粒体的单氧酶系统的作用而形成的，是维生素d在体内的主要储存形式。血液中25-羟基维生素d的浓度能够反映人体内维生素d水平，是检测个体维生素d水平的最佳生化指标。
25-羟基维生素d的传统检测方法有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法和化学发光法等。其中化学发光法能够利用自动化设备进行检测，操作相对简便。
中国专利申请cn106199016a提出来一种磁微粒化学发光免疫检测方法来检测血清中25-羟基维生素d。该方法用25-羟基维生素d单克隆抗体包被的羧基化磁微粒与样品中的25-羟基维生素d进行特异性结合，并且进一步加入维生素d衍生物标记的吖啶酯化学发光标记物进行竞争结合，最后通过测定发光强度来定量检测25-羟基维生素d的含量。该方法通过事先用标准25-羟基维生素d的样品测画出标准曲线，从而能够利用全自动化学发光免疫分析系统进行检测，具有较高的检测灵敏度和准确性。
但是，血液中的25-羟基维生素d与维生素d结合蛋白具有高度亲和力，要检测人血中的总25-羟基维生素d浓度，需要将其从结合蛋白上解离下来，常用的解离剂一般为ph酸性。血浆样本比血清样本蛋白含量高，在ph酸性环境下会等电析出大量蛋白物质，特别是血浆纤维蛋白，这些析出的蛋白物质会附着到磁微粒的表面，对采用磁微粒的检测方法造成干扰，造成血清和血浆测定结果差异较大。因此，目前采用磁微粒检测25-羟基维生素d的方法大多仅能检测血清样品，而不能用于检测血浆样品。
雅培(abbott)的25-羟基维生素d测定试剂盒也是利用磁微粒-化学发光法来测定25-羟基维生素d的试剂盒。样品量只有10μl，且采用两种不同的预处理液对样品进行混合孵育，再从中取出一部分进行检测。该方法对样品进行预处理液处理和稀释后，干扰物浓度大大下降，从而基本消除了血浆样品干扰物对测定结果的影响，是目前能够同时用于血清和血浆样品来检测25-羟基维生素d的试剂盒。
然而，该方法需要对样品进行预处理，不仅增加了检测步骤，而且延长了检测时间。另外因加入两种预处理液，造成样品的稀释，检测样品量小，造成该试剂盒灵敏度不高，线性受到影响等缺陷。此外，尽管经过了预先处理，但是最终的检测结果在血清和血浆之间仍存在一定的差异。因此，能够同时用于血清和血浆样品来检测25-羟基维生素d的方法仍存在改进的需求。
技术实现要素：
本发明的目的是解决上述技术问题中的至少一种。为此，本发明的目的是提供一种能够利用常规的全自动化学发光免疫分析仪对血清和血浆样品中的任意一种检测其中25-羟基维生素d的方法，所获得的检测结果基本不因样品是血清还是血浆而有显著的差异。
具体地，本发明提供一种检测25-羟基维生素d的方法，所述方法包括：
用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育，其中所述第一试剂包括在酸性缓冲溶液中的第一磁微粒和第二磁微粒，其中所述第一磁微粒是包被有链酶亲和素磁微粒，所述第二磁微粒是与所述第一磁微粒不同的磁微粒；所述第二试剂包括25-羟基维生素d抗体标记物；
进一步加入包括生物素化的25-羟基维生素d的第三试剂共孵育；和
分离第一和第二磁微粒；
加入发光底物并检测发光强度。
所述包被有链酶亲和素的磁微粒没有特别限制，可以是市售的那些磁微粒，例如jsrlifesciences公司的ms300/streptavidin磁微粒，但不限于此。第一磁微粒在第一试剂中的浓度可根据不同产品而不同，常规地可为0.1-1mg/ml，优选为0.1-0.4mg/ml，最优选为0.2mg/ml。
所述第二磁微粒可为表面被-cooh、-tosyl、-nh2或-oh改性的磁微粒。优选表面被羧基改性的磁微粒。
所述第二磁微粒在第一试剂中的浓度为0.4-1mg/ml，优选为0.4-0.8mg/ml，最优选为0.6mg/ml。
所述第一试剂中，所述第二磁微粒与第一磁微粒的质量比为2:1-8:1，考虑成本因素优选为2:1-4:1，最优选为3:1。
所述第一和第二磁微粒的粒径通常在1.0-3.0μm的范围内，二者可以相同，也可以不同。特别是上述范围内的第二磁微粒的粒径，对检测准确性没有显著影响。
所述第一试剂中的酸性缓冲溶液可为ph值为3.00-6.00的任何适宜缓冲液。具体实例有：0.2m的醋酸-醋酸钠缓冲液(～ph4.5)，但不限于此。
根据优选的实施方式，第一试剂可由ph为3.00-6.00的缓冲液、0.1-0.4mg/ml的所述第一磁微粒、0.4-0.8mg/ml的所述第二磁微粒组成。根据更优选的实施方式，第一试剂可由ph为4.5的0.2m的醋酸-醋酸钠缓冲液、粒径为1.5μm的0.2mg/ml的包被有链酶亲和素的所述第一磁微粒和粒径为1.5μm的0.6mg/ml的表面修饰有羧酸的所述第二磁微粒组成。
所述第二试剂中的25-羟基维生素d抗体标记物是能够用于定量检测25-羟基维生素d的物质，其中所述标记物可选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、三联吡啶钌中的任意一种，最优选为辣根过氧化物酶。
所述25-羟基维生素d抗体标记物的在第二试剂中的浓度为50-200ng/ml，优选80-130ng/ml，最优选为100ng/ml。
所述第二试剂可常规地含有必要的添加剂，包括缓冲剂、氯化钠、蔗糖、表面活性剂、防腐剂等，但不限于此。这些添加剂可根据常规需求添加，而无特别限制。
本发明中的第二试剂为常规进行检测用的含25-羟基维生素d抗体标记物的试剂，并无特别限制。
根据一种示例性的实施方式，所述第二试剂由0.1mol/l的tris-hcl缓冲液、8.5g/l的氯化钠、20g/l的蔗糖、20g/l的聚乙二醇20000、1ml/l的procline950、0.5ml/l的吐温-20、100ng/ml的辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素d抗体组成。
用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育在约37℃下进行10-30分钟。
所述生物样本可为血清或血浆样本。在具体实施方式中，所述生物样本取自哺乳动物，尤其取自人。
第三试剂中的所述生物素化的25-羟基维生素d可以是任何市售的产品，例如菲鹏生物股份有限公司的货号：vd-bio，但不限于此。
在第三试剂中，所述生物素化的25-羟基维生素d的浓度通常可为0.5-2ng/ml，优选为1ng/ml。
同样的第三试剂可常规地含有添加剂，例如：缓冲剂、氯化钠、蔗糖、表面活性剂、防腐剂等，但不限于此。这些添加剂可根据常规需求添加，而无特别限制。
本发明的第三试剂也是常规试剂，并无特别限制
根据一个示例性的实施方式，第三试剂由0.1mol/l的tris-hcl缓冲液、8.5g/l的氯化钠、20g/l的蔗糖、1ml/l的procline950、0.5ml/l的吐温-20、1ng/ml的生物素化的25-羟基维生素d组成。
用所述生物素化的25-羟基维生素d共孵育在约37℃下进行10-30分钟，优选进行20分钟。
根据一种优选的实施方式，本发明的检测25-羟基维生素d的方法包括以下步骤：
用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育，其中
所述第一试剂包括在ph值为3.00-6.00的酸性缓冲溶液中的质量比为2:1-4:1第二磁微粒和第一磁微粒，其中所述第一磁微粒是包被有链酶亲和素的磁微粒，所述第二磁微粒是表面修饰有羧基、甲苯磺酰基、氨基或羟基的非特异性磁微粒；和
所述第二试剂含有由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯或三联吡啶钌标记的25-羟基维生素d抗体；
进一步加入包括生物素化的25-羟基维生素d的第三试剂共孵育；
分离第一和第二磁微粒；和
加入发光底物并检测发光强度。
根据最优的一种实施方式，本发明的检测25-羟基维生素d的方法包括：
用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育；
进一步加入包括生物素化的25-羟基维生素d的第三试剂共孵育；
分离第一和第二磁微粒；
加入发光底物并检测发光强度，
其中，所述第一试剂由ph4.5的0.2m的醋酸-醋酸钠缓冲液、0.2mg/ml的包被链酶亲和素的第一磁微粒、0.6mg/ml的表面修饰有羧酸的第二磁微粒组成；
所述第二试剂由0.1mol/l的tris-hcl缓冲液、8.5g/l的氯化钠、20g/l的蔗糖、20g/l的聚乙二醇20000、1ml/l的procline950、0.5ml/l的吐温-20、100ng/ml的辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素d抗体组成；
所述第三试剂由0.1mol/l的tris-hcl缓冲液、8.5g/l的氯化钠、20g/l的蔗糖、1ml/l的procline950、0.5ml/l的吐温-20、1ng/ml的生物素化的25-羟基维生素d组成。
本发明的方法同时适用于在血清和血浆样品中检测25-羟基维生素d，而不需额外的样本处理试剂，也不需额外的处理样品的步骤。本发明的方法尤其可以使用常规的磁微粒检测试剂盒和自动检测设备，仅在原含有磁微粒的试剂中以一定比例加入本发明的第二磁微粒，即可按原步骤进行检测。对来自同一受试者的血清样品和血浆样品的检测结果的标准偏差在±15％之内，较佳的实施方式中，标准偏差可在±10％之内，完全符合检测试剂盒检测准确性的要求。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1测定相同来源血清和血浆样本的结果比较
材料与试剂
取来自20位受试者的血清/血浆(edta-k2)对，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d主校准品1套，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d测定试剂盒(化学发光法)2盒(批号：0417011，规格：100测试/盒)，
迈克生物股份有限公司清洗缓冲液(货号：im4202458，批号：0417141)
迈克生物股份有限公司全自动免疫检验系统用底物液(酶促化学发光底物液(hrp))(货号：im4202459，批号：0417031)
迈克生物股份有限公司is1200全自动化学发光免疫分析仪(设备编号：1015-01024)。
25-羟基维生素d测定试剂盒包含如下试剂：
第一试剂(r1)：0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph为4.5)，作为第一磁微粒的链霉亲和素磁微粒0.2mg/ml；
第三试剂(r2)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，生物素化的25-羟基维生素d1ng/ml；
第二试剂(r3)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，聚乙二醇2000020g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素d抗体100ng/ml。
另准备第二磁微粒：羧基磁微粒(厂家：jsrlifesciences，货号：ms160/carboxyl，粒径：1.5μm)。
先用未添加第二磁微粒的25-羟基维生素d测定试剂盒检测25-羟基维生素d主校准品和20对血清/血浆样本，计算血浆测值与血清测值的偏差；
再用添加了终浓度为0.6mg/ml的第二磁微粒的25-羟基维生素d测定试剂盒检测25-羟基维生素d主校准品和同样的20对血清/血浆样本，计算血浆测值与血清测值的偏差。
具体方法是将15μl样本与100μl第一试剂和100μl第二试剂混匀后，37℃反应20分钟，再加入100μl第三试剂，混匀后37℃再反应20分钟。磁分离得到磁微粒，清洗缓冲液洗涤3次，加入发光底物液，检测信号值。
最后，用雅培(abbott)的25-羟基维生素d测定试剂盒按说明书要求重复上述测定。
两次检测结果如下表1所示：
表1
由上表可知不添加第二磁微粒的试剂盒测定20对血清/血浆样本相对偏差在30.25％-106.12％之间，差异性非常大。添加第二磁微粒后，相对偏差在2.29％-9.89％之间，效果很明显。用市场上现有的能测血清血浆样本的雅培(abbott)试剂盒测定这20对样本，相对偏差在-4.96％-10.52％之间。说明本发明添加磁微粒后的试剂盒与雅培试剂盒一样，满足yy/t1585-2017总25-羟基维生素d测定试剂盒(标记免疫分析法)对试剂盒准确度要求(相对偏差在±15％范围内)，既能用于血清样品也能用于血浆样品的测量，且其效果与雅培试剂盒的效果相当。
实施例2第二磁珠的不同加入量；
材料与试剂
与实施例1相同的来自20位受试者的血清/血浆(edta-k2)对，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d主校准品1套，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d测定试剂盒(化学发光法)3盒(批号：0417011，规格：100测试/盒)，
迈克生物股份有限公司清洗缓冲液(货号：im4202458，批号：0417141)
迈克生物股份有限公司全自动免疫检验系统用底物液(酶促化学发光底物液(hrp))(货号：im4202459，批号：0417031)
迈克生物股份有限公司is1200全自动化学发光免疫分析仪(设备编号：1015-01024)
25-羟基维生素d测定试剂盒包含如下试剂：
第一试剂(r1)：0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.5)，作为第一磁微粒的链霉亲和素磁微粒0.2mg/ml；
第三试剂(r2)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，生物素化的25-羟基维生素d1ng/ml；
第二试剂(r3)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，聚乙二醇2000020g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素d抗体100ng/ml。
另准备第二磁微粒：羧基磁微粒(厂家：jsrlifesciences，货号：ms160/carboxyl，粒径：1.5μm)。
将3盒试剂盒的第一试剂分别添加终浓度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml的第二磁微粒，再用这3盒添加了第二磁微粒的25-羟基维生素d测定试剂盒检测25-羟基维生素d主校准品和20对血清/血浆样本，计算血浆测值与血清测值的偏差。
具体方法是将15μl样本与100μl第一试剂和100μl第二试剂混匀后，37℃反应20分钟，再加入100μl第三试剂，混匀后37℃再反应20分钟。磁分离得到磁微粒，清洗缓冲液洗涤3次，加入发光底物液，检测信号值。
两次检测结果如下表2所示：
表2
由上表可知以1:1的比例(第二磁微粒比第一磁微粒)添加0.2mg/ml第二磁微粒的试剂盒测定20对血清/血浆样本相对偏差在5.01％-48.33％之间，超出yy/t1585-2017总25-羟基维生素d测定试剂盒(标记免疫分析法)对试剂盒准确度要求(相对偏差在±15％范围内)，判定为不能测定血清/血浆；以2:1的比例添加0.4mg/ml第二磁微粒的试剂盒，相对偏差在5.18％-14.77％之间，可满足试剂盒准确度要求，判定为可测定血清血浆，但差异较大；以4:1的比例添加0.8mg/ml第二磁微粒的试剂盒，相对偏差在3.81％-8.82％之间，满足试剂盒准确度要求，判定为可测定血清血浆。
实施例3
材料与试剂
与实施例1相同的来自20位受试者的的血清/血浆(edta-k2)对，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d主校准品1套，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d测定试剂盒(化学发光法)3盒(批号：0417011，规格：100测试/盒)，
迈克生物股份有限公司清洗缓冲液(货号：im4202458，批号：0417141)
迈克生物股份有限公司全自动免疫检验系统用底物液(酶促化学发光底物液(hrp))(货号：im4202459，批号：0417031)
迈克生物股份有限公司is1200全自动化学发光免疫分析仪(设备编号：1015-01024)
25-羟基维生素d测定试剂盒包含如下试剂：
第一试剂(r1)：0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.5)，作为第一磁微粒的链霉亲和素磁微粒0.2mg/ml；
第三试剂(r2)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，生物素化的25-羟基维生素d1ng/ml；
第二试剂(r3)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，聚乙二醇2000020g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素d抗体100ng/ml。
第二磁微粒：tosyl磁微粒(厂家：jsrlifesciences，货号：ms160/tosyl，粒径：1.5μm)。
将3盒试剂盒的第一试剂分别添加终浓度为0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml的第二磁微粒，再用这3盒添加了第二磁微粒的25-羟基维生素d测定试剂盒检测25-羟基维生素d主校准品和20对血清/血浆样本，计算血浆测值与血清测值的偏差。
具体方法是将15μl样本与100μl第一试剂和100μl第二试剂混匀后，37℃反应20分钟，再加入100μl第三试剂，混匀后37℃再反应20分钟。磁分离得到磁微粒，清洗缓冲液洗涤3次，加入发光底物液，检测信号值。
两次检测结果如下表3所示：
表3
由上表可知添加0.4mg/mltosyl磁微粒的试剂盒测定20对血清血浆样本相对偏差在0.60％-14.52％之间，满足试剂盒准确度要求；添加0.6mg/mltosyl磁微粒的试剂盒，相对偏差在1.82％-11.56％之间，满足试剂盒准确度要求；添加0.8mg/mltosyl磁微粒的试剂盒，相对偏差在2.04％-9.96％之间，满足试剂盒准确度要求。
实施例4
材料与试剂
与实施例1相同的来自20位受试者的的血清/血浆(edta-k2)对，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d主校准品1套，
迈克生物股份有限公司25-羟基维生素d测定试剂盒(化学发光法)2盒(批号：0417011，规格：100测试/盒)，
迈克生物股份有限公司清洗缓冲液(货号：im4202458，批号：0417141)
迈克生物股份有限公司全自动免疫检验系统用底物液(酶促化学发光底物液(hrp))(货号：im4202459，批号：0417031)
迈克生物股份有限公司is1200全自动化学发光免疫分析仪(设备编号：1015-01024)
25-羟基维生素d测定试剂盒包含如下试剂：
第一试剂(r1)：0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.5)，作为第一磁微粒的链霉亲和素磁微粒0.2mg/ml；
第三试剂(r2)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，生物素化的25-羟基维生素d1ng/ml；
第二试剂(r3)：0.1mol/ltris-hcl缓冲液，氯化钠8.5g/l，蔗糖20g/l，聚乙二醇2000020g/l，procline9501ml/l，吐温-200.5ml/l，辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素d抗体100ng/ml。
另备两种第二磁微粒：tosyl磁微粒(厂家：jsrlifesciences，货号：ms300/tosyl，粒径：3.0μm)和羧基磁微粒(厂家：jsrlifesciences，货号：mx200/carboxyl，粒径：2.1μm)。
两盒试剂盒第一盒的第一试剂添加终浓度为0.6mg/ml的tosyl磁微粒，第二盒的第一试剂添加终浓度为0.6mg/ml的羧基磁微粒，用这2盒添加了第二磁微粒的25-羟基维生素d测定试剂盒检测25-羟基维生素d主校准品和20对血清/血浆样本，计算血浆测值与血清测值的偏差。
具体方法是将15μl样本与100μl第一试剂和100μl第二试剂混匀后，37℃反应20分钟，再加入100μl第三试剂，混匀后37℃再反应20分钟。磁分离得到磁微粒，清洗缓冲液洗涤3次，加入发光底物液，检测信号值。
两次检测结果如下表4所示：
表4
由上表可知添加0.6mg/ml粒径为3.0μmtosyl磁微粒的试剂盒测定20对血清血浆样本相对偏差在1.89％-11.40％之间，满足试剂盒准确度要求；添加0.6mg/ml粒径为2.1μm羧基磁微粒后再测定，相对偏差在0.48％-10.46％之间，同样满足试剂盒准确度要求。