一种检测二甲戊灵的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明属于农药残留检测领域，具体涉及一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用，其特别适用于农产品、烟草及烟草制品中二甲戊灵残留的检测。

背景技术：

二甲戊灵是一种旱田作物选择性除草剂，可以广泛应用于玉米、大豆、花生、棉花、直播旱稻、马铃薯、烟草、蔬菜等多种作物田除草。目前，二甲戊灵是世界第三大除草剂，销售额仅次于灭生性除草剂草甘膦、百草枯，也是世界上销售额最大的选择性除草剂，在我国农业生产中的应用非常广泛。因此，二甲戊灵在农作物中的残留问题也受到了高度关注。gb2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定二甲戊灵在稻谷、韭菜、结球甘蓝、普通白菜、菠菜、芹菜、大白菜中的最大残留限量（mrl）为0.2mg/kg，在糙米、玉米、棉籽、大蒜、莴苣中的mrl为0.1mg/kg；美国规定二甲戊灵在豆类、茶叶、大蒜中的mrl为0.1mg/kg，在韭菜中的mrl为0.2mg/kg，在胡萝卜中的mrl为0.5mg/kg；欧盟规定二甲戊灵在豆类、胡萝卜中的mrl为0.2mg/kg，在芹菜中的mrl为0.1mg/kg。国际烟草科学研究合作中心（coresta）规定烟草中二甲戊灵的指导性残留限量为5mg/kg，我国尚未制定烟草中二甲戊灵的最大残留限量。

目前二甲戊灵的检测方法主要是仪器检测方法，如气相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱串联质谱法，等。但是由于这些分析方法需要昂贵的大型仪器设备和专业的检测人员、前处理过程复杂、操作繁琐、检测成本高、分析速度慢，难以满足现场监测和大量样本中农药残留量快速筛查的需要。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。

荧光微球免疫层析技术是在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，具有快速、操作简便等优点。相比传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。截至目前，市场上尚未有二甲戊灵荧光微球免疫层析试纸条出现。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的二甲戊灵残留检测荧光微球免疫层析试纸条；本发明的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法；本发明的再一个目的是提供上述试纸条在检测二甲戊灵中的应用。

为了实现上述目的，本发明采取的一个技术方案是：

提供一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，它包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述二甲戊灵单克隆抗体是以二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述二甲戊灵半抗原是由3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛与3-肼基丙酸反应得到，其分子结构式为：

。

所述二甲戊灵半抗原的制备方法如下：

取0.60g3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛，加50ml乙腈溶解，澄清后，滴加溶解0.32g3-肼基丙酸的甲醇溶液5ml，室温搅拌3h；停止反应，旋蒸除去有机溶剂，加水，加氢氧化钠0.45g，溶解澄清后，加80ml乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相加稀盐酸调节ph=4，加50ml氯仿萃取，水洗，浓缩，用体积比1:1的乙醇/石油醚重结晶，得到半抗原产物0.70g。

所述二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述二甲戊灵单克隆抗体是由二甲戊灵单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述荧光微球是直径为100~300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—cooh基团，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素。

本发明采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条的方法，它包括如下步骤：

1）样品结合垫的制备：用市售的荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；

2）硝酸纤维素膜的制备：将二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；

3）组装和剪切：在底板上依次搭接粘贴包埋有荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：将3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛与3-肼基丙酸经过一系列反应得到二甲戊灵半抗原产物；

2）将二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联，得到二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到二甲戊灵单克隆杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）分别将二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜的检测区范围（t）和质控区范围（c）；

6）将样品结合垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量）、ph值为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37℃下烘干2h；

7）用市售的荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将6）处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用；

8）在底板上依次搭接粘贴包埋有荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。

本发明采取的另一个技术方案是提供一种上述检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条在检测二甲戊灵中的应用，它包括如下步骤：

1）样品前处理；

2）用所述的检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条进行检测；

3）用荧光检测仪分析检测结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）特异性强、灵敏度高：本试纸条采用将荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体包埋在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的反应灵敏度；

（2）荧光微球表面包裹了聚苯乙烯，实现了对荧光物质异硫氰酸荧光素的保护，减少了外界环境的干扰，增加了荧光微球的稳定性及荧光寿命；

（3）荧光微球表面修饰活性基团—cooh，采用化学偶联的方法来标记抗体，形成抗体与微球的稳定结合。

目前尚无用于检测农产品、烟草及烟草制品中二甲戊灵的荧光微球免疫层析试纸条，本发明填补了该空白。本发明的半抗原具有适当末端活性基团，修饰位点及间隔臂长度选择合适，且能最大程度模拟二甲戊灵的分子结构，以此半抗原为基础开发的试纸条具有灵敏度高、特异性强的特点。同时本发明的试纸条具有成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。综上，用本发明试纸条检测二甲戊灵残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为荧光微球免疫层析试纸条剖面结构示意图，图中：1、样品结合垫；2、硝酸纤维素膜；3、吸水垫；4、检测区；5、质控区；6、底板；

图2为荧光微球免疫层析试纸条俯视图；

图3为二甲戊灵半抗原合成图（该图作为摘要附图）。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条的构成

参见图1：所述试纸条是由底板、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。

所述样品结合垫1、硝酸纤维素膜2和吸水垫3依次按顺序搭接粘贴在底板6上，样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。

所述硝酸纤维素膜上固定有检测区4和质控区5，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体。

所述底板为pvc底板；所述样品结合垫为玻璃棉；所述吸水垫为吸水纸。

实施例2检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1）样品结合垫的制备：用市售的荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；

2）硝酸纤维素膜的制备：将二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；

3）组装和剪切：在底板上依次搭接粘贴包埋有荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。

下面分步详细叙述：

（一）各部件的制备

1、二甲戊灵半抗原的制备

取0.60g3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛，加50ml乙腈溶解，澄清后，滴加溶解0.32g3-肼基丙酸的甲醇溶液5ml，室温搅拌3h；停止反应，旋蒸除去有机溶剂，加水，加氢氧化钠0.45g，溶解澄清后，加80ml乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相加稀盐酸调节ph=4，加50ml氯仿萃取，水洗，浓缩，用体积比1:1的乙醇/石油醚重结晶，得到半抗原产物0.70g，收率90.1%。

取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，¹h-nmr（cdcl3，300mhz）δ:8.505(10，1h)，4.363(11，1h，quint，j=6.864)，8.326(13，1h)，2.247(14，3h)，1.525(16，2h，qd，j=7.141，j=6.864)，1.525(17，2h，qd，j=7.141，j=6.864)，0.822(21，3h，t，j=7.141)，0.822(22，3h，t，j=7.141)，3.680(23，2h，t，j=6.869)，2.679(24，2h，t，j=6.869)。化学位移δ=3.680、2.679为半抗原间隔臂上的氢的共振吸收峰，这两个峰的存在及位置表明半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

二甲戊灵半抗原与牛血清白蛋白（bsa）偶联得到免疫原。

取15mg半抗原，溶解于1mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中；加8mg碳化二亚胺（edc），室温下搅拌24h，得到反应液a；称取bsa30mg，使之充分溶解在4ml0.1mol/l磷酸盐缓冲液（pb，ph值为7.0）中，将反应液a逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液（pbs）4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到免疫原，分装，-20℃保存。

3、包被原的制备

二甲戊灵半抗原与卵清蛋白（ova）偶联得到包被原。

取20mg半抗原，溶解于1mldmf中；加10mg二环已基碳化二亚胺（dcc），室温下搅拌24h，抽滤，除去不溶固体，得到反应液a；称取ova30mg，使之充分溶解在6ml0.1mol/lpb（ph值为7.0）中，将反应液a逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/lpbs4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到包被原，分装，-20℃保存。

4、二甲戊灵单克隆抗体的制备

（1）杂交瘤细胞的获得

首次免疫：将二甲戊灵半抗原-bsa偶联物（免疫原）与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的balb/c小鼠，每只0.2ml；

加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1ml，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；

采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。

（2）单克隆抗体的制备

细胞复苏：取出二甲戊灵单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到二甲戊灵单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

（3）单克隆抗体效价的测定

用间接竞争elisa法测定抗体的效价为1:(300000~700000)。

间接竞争elisa方法：用二甲戊灵半抗原-ova偶联物包被酶标板，加入二甲戊灵标准品溶液、二甲戊灵单克隆抗体溶液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液，25℃反应30min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3~5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

（4）单克隆抗体特异性的测定

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将二甲戊灵、氟节胺、仲丁灵、氟乐灵、乙丁氟灵等二硝基苯胺类除草剂做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争elisa，制作标准曲线，分析得到ic50，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：二甲戊灵100%、氟节胺＜1%、仲丁灵＜1%、氟乐灵＜1%、乙丁氟灵＜1%。本发明抗体对氟节胺、仲丁灵、氟乐灵、乙丁氟灵等其他二硝基苯胺类除草剂无交叉反应，只针对二甲戊灵有特异性结合。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体的制备

（1）活化：取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μl混悬于900μl活化缓冲液中，于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬微球于1ml活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温振荡活化10min；

（2）偶联：将（1）所述混悬液于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10~20μl二甲戊灵单克隆抗体溶液（蛋白浓度1mg/ml），混匀后室温振荡偶联120min；

（3）封闭：将（2）所述混悬液于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬于封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温震荡封闭30min；

（4）贮存：将（3）所述混悬液于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。

所述活化缓冲液为ph值为5.5~6.5、0.05mol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸（mes）缓冲液。

所述活化剂为水溶性碳二亚胺，其中摩尔质量比edc∶nhs∶cooh=(1.5~3)∶(8~20)∶1，临用前用活化缓冲液稀释至所需浓度。

所述偶联缓冲液为ph值为7.5~8.50.05mol/l的硼酸盐缓冲液（避免使用存在游离胺的溶剂）。

所述封闭缓冲液为含0.1~0.4mol/l伯胺（盐酸羟胺、乙醇胺或氨基乙醇）、1%~10%bsa的ph值为7.4的pb缓冲液。

所述贮存缓冲液为含0.01%nan3、0.1%bsa的ph值为7.4的pb缓冲液。

7、样品结合垫的制备

（1）将样品结合垫用含牛血清白蛋白（bsa在缓冲体系中的终浓度为0.5%，体积百分含量）、ph值为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37℃下烘干2h；

（2）将贮存的荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体以贮存缓冲液稀释后，将（1）处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用。

8、硝酸纤维素（nc）膜的制备

用0.05mol/l、ph值为7.2的pbs缓冲液将二甲戊灵半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到100μg/ml，用isoflow点膜仪将其喷涂于nc膜上的检测区（t），喷膜量为1.0μl/cm；用0.01mol/l、ph值为7.4的pbs缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其喷涂于nc膜上的质控区（c），喷膜量为1.0μl/cm。将制备好的nc膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

（二）试纸条的组装

将样品结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。二甲戊灵荧光微球免疫层析试纸卡在2~8℃阴凉避光干燥保存，有效期为12个月。

实施例3检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条的应用

1、样品前处理

称取1.0±0.05g匀浆后的待测样品至50ml离心管中，加入10ml乙腈，用旋涡仪涡动1min，室温（20~25℃）3000rpm以上离心5min；取上清液2ml至10ml离心管中，在40-50℃水浴中氮气吹干，加入500μl样本复溶液，用涡旋仪涡动2min，混匀待测。

2、用试纸条检测

吸取100μl待检样本溶液垂直滴加于试纸卡加样孔中，液体流动时开始计时，反应10min；将试纸卡插入kft-100a型荧光检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对试纸卡进行扫描测试，通过仪器的显示屏幕上读取或打印检测结果。

3、检测结果分析

测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出烟叶样本中二甲戊灵的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。

阴性（－）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示样本中不含有二甲戊灵或其浓度低于检测限。

阳性（+）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示样本中二甲戊灵浓度等于或高于检测限。

无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。

实施例4检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条技术参数的确定

1、检测限试验

向空白烟草、茶叶、菠菜、芹菜样品中分别添加二甲戊灵标准品至终浓度为0.05、0.1、0.2mg/kg，用荧光微球免疫层析试纸条进行检测，结果为：二甲戊灵浓度为0.05mg/kg时，荧光检测仪检测为阴性；二甲戊灵浓度为0.1、0.2mg/kg时，荧光检测仪检测为阳性，表明本试纸条对烟草、茶叶、菠菜、芹菜中二甲戊灵的检测限为0.1mg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

分别取已知二甲戊灵含量大于检测限的烟草阳性样本和含量小于检测限的阴性样本各20份，用3个批次生产的荧光微球免疫层析试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见下表。

表1检测阳性、阴性样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100%，假阴性率为0；检测阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。说明本发明的检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条可以对烟叶中二甲戊灵残留进行快速检测。

3、特异性试验

用二甲戊灵试纸条检测5mg/l的氟节胺、仲丁灵、氟乐灵、乙丁氟灵等二硝基苯胺类除草剂，结果显示呈阴性。说明本试纸条对5mg/l的二甲戊灵、仲丁灵、氟乐灵、乙丁氟灵等二硝基苯胺类除草剂无交叉反应，特异性良好。